Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
Диференційне центрифугування (також відоме як центрифугування з диференційною швидкістю), у біохімії та клітинній біології, є процедурою, яка використовується для розділення органел та інших субклітинних частинок на основі їх швидкості седиментації. Незважаючи на те, що диференційне центрифуґування часто застосовується при біологічних аналізах, це загальний метод, який також підходить для грубого очищення неживих зважених частинок (наприклад, наночастинок, колоїдних частинок, вірусів). У типовому випадку, коли диференційне центрифуґування використовується для аналізу клітинних біологічних явищ (наприклад, розподіл органел), тканина спочатку лізується для руйнування клітинних мембран і звільнення органел і цитозолю. Потім лізат піддають повторним центрифуґуванням, під час яких частинки, які досить швидко осідають при заданій відцентровій силі протягом певного часу, утворюють компактну «гранулу» на дні центрифуґувальної пробірки.
Після кожного центрифуґування супернатант (розчин без гранул) видаляють із пробірки та повторно центрифуґують із збільшеною відцентровою силою та/або часом. Диференційне центрифуґування придатне для сирого поділу на основі швидкости седиментації, але більш дрібнозернисте очищення можна проводити на основі щільности за допомогою рівноважного центрифуґування в градієнті щільности. Таким чином, метод диференційного центрифуґування є послідовним осадженням частинок із попереднього супернатанту з використанням дедалі більших сил центрифуґування. Клітинні органели, розділені диференційним центрифугуванням, зберігають відносно високий рівень нормального функціонування, доки вони не піддаються денатуруючим умовам під час ізоляції Cellular organelles separated by differential centrifugation maintain a relatively high degree of normal functioning, as long as they are not subject to denaturing conditions during isolation..
Теорія
Диференційне центрифуґування виконується під час фракціонування клітин - розділення компонентів клітини після руйнування клітини на органели та цитозольні білки. Розділення у клітинному фракціонуванні зазвичай відбувається центрифуґуванням, при цьому спочатку осідають фрагменти клітинної мембрани та клітинних ядер, а потім мітохондрії та ендоплазматичний ретикулум. Органели клітини можуть залишитися неушкодженими. Після руйнування клітини її складові перебувають у «кашоподібному» стані. Фракціонування клітин часто є лише початком очищення білка, виділення ДНК або РНК.
У в’язкій рідині швидкість осідання даної зваженої частинки, якщо ця частинка є щільнішою за рідину, значною мірою залежить від таких факторів:
- сила гравітації;
- різниця в щільності;
- в'язкість рідини;
- розмір і форма частинок.
Більші частинки осідають швидше та при нижчих відцентрових силах. Якщо частинка має меншу щільність, ніж рідина (наприклад, жири у воді), частинка не осідає, а скоріше плаватиме, незалежно від сили перевантаження, яку відчуває частинка. Відцентрова сила розділяє компоненти не лише на основі щільности, але й розміру та форми частинок. Навпаки, більш спеціалізоване рівноважне центрифуґування в градієнті густини дає профіль поділу, що залежить лише від щільности частинок, і тому підходить для більш дрібнозернистого поділу .
Висока g-сила робить седиментацію малих частинок набагато швидшою, ніж броунівська дифузія, навіть для дуже малих (нанорозмірних) частинок. Коли використовується центрифуґа, закон Стокса необхідно модифікувати, щоб врахувати зміну g-сили з відстанню від центру обертання.
де
- D — мінімальний діаметр частинок, які очікуються для осідання (м);
- η (або μ) – динамічна в’язкість рідини (Па·с);
- R f кінцевий радіус обертання (м);
- R i - початковий радіус обертання (м);
- ρ p – об’ємна масова густина частинок (кг/м 3);
- ρ f – об’ємна масова густина рідини (кг/м 3);
- ω – кутова швидкість (радіан/с);
- t час, необхідний для осадження від R i до R f (с).
Процедура
Диференційне центрифуґування може використовуватися з непошкодженими частинками (наприклад, біологічними клітинами, мікрочастинками, наночастинками) або використовуватися для розділення складових частин. Використовуючи приклад відділення еукаріотичних органел від інтактних клітин, клітина повинна бути спочатку лізована та гомогенізована (в ідеалі за допомогою м’якої техніки, такої як гомогенізація за Доунсом. Надмірна гомогенізація призведе до меншої частки інтактних органел. Після отримання неочищеного екстракту органоїдів, його можна піддати центрифуґуванню на різних швидкостях для розділення органел .
Ультрацентрифуґування
Тепер лізований зразок готовий до центрифугування в ультрацентрифузі. Ультрацентрифуга складається з охолоджуваної камери низького тиску, що містить ротор, який приводиться в рух електричним двигуном, здатним обертатися на високій швидкості. Зразки поміщають у пробірки всередині ротора або прикріплюють до нього. Швидкість обертання може досягати 100 000 об/хв для підлогової моделі, 150 000 об/хв - для настільної моделі, створюючи відцентрові швидкісні сили від 800 000 g до 1 000 000 g. Ця сила викликає осідання макромолекул і навіть може спричинити нерівномірний розподіл малих молекул . Оскільки різні фрагменти клітини мають різні розміри та щільність, кожен фрагмент осідає в гранулу з різними мінімальними відцентровими силами. Таким чином, поділити зразки на різні шари можна спочатку центрифуґуванням вихідного лізату під слабкою силою, видаленням осаду, а потім - піддаванням наступних супернатантів дії послідовно більших відцентрових полів. Кожного разу частина різної щільности осідає на дні контейнера та екстрагується, а повторне застосування створює ряд шарів, який включає різні частини вихідного зразка. Можуть бути зроблені додаткові кроки для подальшого очищення кожної з отриманих гранул. Седиментація залежить від маси, форми та часткового питомого об’єму макромолекули, а також від щільности розчинника, розміру ротора та швидкости обертання. Під час експерименту можна контролювати швидкість седиментації для розрахунку молекулярної маси. Значення коефіцієнта седиментації (S) можна розрахувати. Великі значення S (більша швидкість седиментації) відповідають більшій молекулярній масі. Щільні частинки осідають швидше. Подовжені білки мають більші коефіцієнти тертя та осідають повільніше.
Відмінності між диференційним центрифуґуванням і центрифуґуванням у градієнті густини
Різниця між методами диференційного центрифуґування та центрифуґування в градієнті щільності полягає в тому, що в останньому методі використовуються розчини різної щільности (наприклад, цукроза) або гелі, через які проходить зразок. Це розділяє зразок на шари за відносною щільністю, засноване на принципі, згідно з яким молекули осідають під дією відцентрової сили, доки не досягнуть середовища з такою ж щільністю, як і їх. Ступінь поділу або кількість шарів залежить від розчину або гелю. Диференційне центрифуґування, з іншого боку, не використовує градієнт щільности, і центрифуґування відбувається на зростаючих швидкостях. Різні швидкості центрифуґування часто призводять до поділу не більше ніж на дві фракції, тому надосадову рідину можна розділити на додаткових етапах центрифуґування. Для цього з кожним кроком швидкість центрифугування повинна збільшуватися до тих пір, поки потрібні частинки не будуть розділені. Центрифуґування в градієнті щільности зазвичай виконується лише з однією швидкістю центрифуґування .
Примітки
- Griffith, Owen Mitch (2010). (PDF). Principles & Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. с. 1-27. Архів оригіналу (PDF) за 7 лютого 2023. Процитовано 7 лютого 2023.
- Gerald Karp (19 жовтня 2009). Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments. John Wiley & Sons. с. 28–. ISBN .
- Livshits, Mikhail A.; Khomyakova, Elena; Evtushenko, Evgeniy G.; Lazarev, Vassili N.; Kulemin, Nikolay A.; Semina, Svetlana E.; Generozov, Edward V.; Govorun, Vadim M. (30 листопада 2015). Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports (англ.). 5 (1): 17319. Bibcode:2015NatSR...517319L. doi:10.1038/srep17319. ISSN 2045-2322. PMC 4663484. PMID 26616523. S2CID 14200669.
- Harding, Stephen E.; Scott, David; Rowe, Arther (16 грудня 2007). Analytical Ultracentrifugation: Techniques and Methods (англ.). Royal Society of Chemistry. ISBN .
- Frei, Mark. Centrifugation Separations. BioFiles. 6 (5): 6–7.
- Taylor, Douglas D.; Shah, Sahil (1 жовтня 2015). Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87: 3—10. doi:10.1016/j.ymeth.2015.02.019. PMID 25766927.
- Yu, Li-Li; Zhu, Jing; Liu, Jin-Xia; Jiang, Feng; Ni, Wen-Kai; Qu, Li-Shuai; Ni, Run-Zhou; Lu, Cui-Hua; Xiao, Ming-Bing (2018). A Comparison of Traditional and Novel Methods for the Separation of Exosomes from Human Samples. BioMed Research International (англ.). 2018: 1—9. doi:10.1155/2018/3634563. PMC 6083592. PMID 30148165.
Вікіпедія, Українська, Україна, книга, книги, бібліотека, стаття, читати, завантажити, безкоштовно, безкоштовно завантажити, mp3, відео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, малюнок, музика, пісня, фільм, книга, гра, ігри, мобільний, телефон, android, ios, apple, мобільний телефон, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Інтернет
Diferencijne centrifuguvannya takozh vidome yak centrifuguvannya z diferencijnoyu shvidkistyu u biohimiyi ta klitinnij biologiyi ye proceduroyu yaka vikoristovuyetsya dlya rozdilennya organel ta inshih subklitinnih chastinok na osnovi yih shvidkosti sedimentaciyi Nezvazhayuchi na te sho diferencijne centrifuguvannya chasto zastosovuyetsya pri biologichnih analizah ce zagalnij metod yakij takozh pidhodit dlya grubogo ochishennya nezhivih zvazhenih chastinok napriklad nanochastinok koloyidnih chastinok virusiv U tipovomu vipadku koli diferencijne centrifuguvannya vikoristovuyetsya dlya analizu klitinnih biologichnih yavish napriklad rozpodil organel tkanina spochatku lizuyetsya dlya rujnuvannya klitinnih membran i zvilnennya organel i citozolyu Potim lizat piddayut povtornim centrifuguvannyam pid chas yakih chastinki yaki dosit shvidko osidayut pri zadanij vidcentrovij sili protyagom pevnogo chasu utvoryuyut kompaktnu granulu na dni centrifuguvalnoyi probirki Shema diferencijnogo centrifuguvannya Pislya kozhnogo centrifuguvannya supernatant rozchin bez granul vidalyayut iz probirki ta povtorno centrifuguyut iz zbilshenoyu vidcentrovoyu siloyu ta abo chasom Diferencijne centrifuguvannya pridatne dlya sirogo podilu na osnovi shvidkosti sedimentaciyi ale bilsh dribnozerniste ochishennya mozhna provoditi na osnovi shilnosti za dopomogoyu rivnovazhnogo centrifuguvannya v gradiyenti shilnosti Takim chinom metod diferencijnogo centrifuguvannya ye poslidovnim osadzhennyam chastinok iz poperednogo supernatantu z vikoristannyam dedali bilshih sil centrifuguvannya Klitinni organeli rozdileni diferencijnim centrifuguvannyam zberigayut vidnosno visokij riven normalnogo funkcionuvannya doki voni ne piddayutsya denaturuyuchim umovam pid chas izolyaciyi Cellular organelles separated by differential centrifugation maintain a relatively high degree of normal functioning as long as they are not subject to denaturing conditions during isolation TeoriyaDiferencijne centrifuguvannya vikonuyetsya pid chas frakcionuvannya klitin rozdilennya komponentiv klitini pislya rujnuvannya klitini na organeli ta citozolni bilki Rozdilennya u klitinnomu frakcionuvanni zazvichaj vidbuvayetsya centrifuguvannyam pri comu spochatku osidayut fragmenti klitinnoyi membrani ta klitinnih yader a potim mitohondriyi ta endoplazmatichnij retikulum Organeli klitini mozhut zalishitisya neushkodzhenimi Pislya rujnuvannya klitini yiyi skladovi perebuvayut u kashopodibnomu stani Frakcionuvannya klitin chasto ye lishe pochatkom ochishennya bilka vidilennya DNK abo RNK U v yazkij ridini shvidkist osidannya danoyi zvazhenoyi chastinki yaksho cya chastinka ye shilnishoyu za ridinu znachnoyu miroyu zalezhit vid takih faktoriv sila gravitaciyi riznicya v shilnosti v yazkist ridini rozmir i forma chastinok Bilshi chastinki osidayut shvidshe ta pri nizhchih vidcentrovih silah Yaksho chastinka maye menshu shilnist nizh ridina napriklad zhiri u vodi chastinka ne osidaye a skorishe plavatime nezalezhno vid sili perevantazhennya yaku vidchuvaye chastinka Vidcentrova sila rozdilyaye komponenti ne lishe na osnovi shilnosti ale j rozmiru ta formi chastinok Navpaki bilsh specializovane rivnovazhne centrifuguvannya v gradiyenti gustini daye profil podilu sho zalezhit lishe vid shilnosti chastinok i tomu pidhodit dlya bilsh dribnozernistogo podilu D 18 h ln R f R i r p r f w 2 t displaystyle D sqrt frac 18 eta ln R f R i rho p rho f omega 2 t Visoka g sila robit sedimentaciyu malih chastinok nabagato shvidshoyu nizh brounivska difuziya navit dlya duzhe malih nanorozmirnih chastinok Koli vikoristovuyetsya centrifuga zakon Stoksa neobhidno modifikuvati shob vrahuvati zminu g sili z vidstannyu vid centru obertannya de D minimalnij diametr chastinok yaki ochikuyutsya dlya osidannya m h abo m dinamichna v yazkist ridini Pa s R f kincevij radius obertannya m R i pochatkovij radius obertannya m r p ob yemna masova gustina chastinok kg m 3 r f ob yemna masova gustina ridini kg m 3 w kutova shvidkist radian s t chas neobhidnij dlya osadzhennya vid R i do R f s ProceduraDiferencijne centrifuguvannya mozhe vikoristovuvatisya z neposhkodzhenimi chastinkami napriklad biologichnimi klitinami mikrochastinkami nanochastinkami abo vikoristovuvatisya dlya rozdilennya skladovih chastin Vikoristovuyuchi priklad viddilennya eukariotichnih organel vid intaktnih klitin klitina povinna buti spochatku lizovana ta gomogenizovana v ideali za dopomogoyu m yakoyi tehniki takoyi yak gomogenizaciya za Dounsom Nadmirna gomogenizaciya prizvede do menshoyi chastki intaktnih organel Pislya otrimannya neochishenogo ekstraktu organoyidiv jogo mozhna piddati centrifuguvannyu na riznih shvidkostyah dlya rozdilennya organel UltracentrifuguvannyaTeper lizovanij zrazok gotovij do centrifuguvannya v ultracentrifuzi Ultracentrifuga skladayetsya z oholodzhuvanoyi kameri nizkogo tisku sho mistit rotor yakij privoditsya v ruh elektrichnim dvigunom zdatnim obertatisya na visokij shvidkosti Zrazki pomishayut u probirki vseredini rotora abo prikriplyuyut do nogo Shvidkist obertannya mozhe dosyagati 100 000 ob hv dlya pidlogovoyi modeli 150 000 ob hv dlya nastilnoyi modeli stvoryuyuchi vidcentrovi shvidkisni sili vid 800 000 g do 1 000 000 g Cya sila viklikaye osidannya makromolekul i navit mozhe sprichiniti nerivnomirnij rozpodil malih molekul Oskilki rizni fragmenti klitini mayut rizni rozmiri ta shilnist kozhen fragment osidaye v granulu z riznimi minimalnimi vidcentrovimi silami Takim chinom podiliti zrazki na rizni shari mozhna spochatku centrifuguvannyam vihidnogo lizatu pid slabkoyu siloyu vidalennyam osadu a potim piddavannyam nastupnih supernatantiv diyi poslidovno bilshih vidcentrovih poliv Kozhnogo razu chastina riznoyi shilnosti osidaye na dni kontejnera ta ekstraguyetsya a povtorne zastosuvannya stvoryuye ryad shariv yakij vklyuchaye rizni chastini vihidnogo zrazka Mozhut buti zrobleni dodatkovi kroki dlya podalshogo ochishennya kozhnoyi z otrimanih granul Sedimentaciya zalezhit vid masi formi ta chastkovogo pitomogo ob yemu makromolekuli a takozh vid shilnosti rozchinnika rozmiru rotora ta shvidkosti obertannya Pid chas eksperimentu mozhna kontrolyuvati shvidkist sedimentaciyi dlya rozrahunku molekulyarnoyi masi Znachennya koeficiyenta sedimentaciyi S mozhna rozrahuvati Veliki znachennya S bilsha shvidkist sedimentaciyi vidpovidayut bilshij molekulyarnij masi Shilni chastinki osidayut shvidshe Podovzheni bilki mayut bilshi koeficiyenti tertya ta osidayut povilnishe Vidminnosti mizh diferencijnim centrifuguvannyam i centrifuguvannyam u gradiyenti gustiniRiznicya mizh metodami diferencijnogo centrifuguvannya ta centrifuguvannya v gradiyenti shilnosti polyagaye v tomu sho v ostannomu metodi vikoristovuyutsya rozchini riznoyi shilnosti napriklad cukroza abo geli cherez yaki prohodit zrazok Ce rozdilyaye zrazok na shari za vidnosnoyu shilnistyu zasnovane na principi zgidno z yakim molekuli osidayut pid diyeyu vidcentrovoyi sili doki ne dosyagnut seredovisha z takoyu zh shilnistyu yak i yih Stupin podilu abo kilkist shariv zalezhit vid rozchinu abo gelyu Diferencijne centrifuguvannya z inshogo boku ne vikoristovuye gradiyent shilnosti i centrifuguvannya vidbuvayetsya na zrostayuchih shvidkostyah Rizni shvidkosti centrifuguvannya chasto prizvodyat do podilu ne bilshe nizh na dvi frakciyi tomu nadosadovu ridinu mozhna rozdiliti na dodatkovih etapah centrifuguvannya Dlya cogo z kozhnim krokom shvidkist centrifuguvannya povinna zbilshuvatisya do tih pir poki potribni chastinki ne budut rozdileni Centrifuguvannya v gradiyenti shilnosti zazvichaj vikonuyetsya lishe z odniyeyu shvidkistyu centrifuguvannya PrimitkiGriffith Owen Mitch 2010 PDF Principles amp Techniques of Biochemistry and Molecular Biology s 1 27 Arhiv originalu PDF za 7 lyutogo 2023 Procitovano 7 lyutogo 2023 Gerald Karp 19 zhovtnya 2009 Cell and Molecular Biology Concepts and Experiments John Wiley amp Sons s 28 ISBN 978 0 470 48337 4 Livshits Mikhail A Khomyakova Elena Evtushenko Evgeniy G Lazarev Vassili N Kulemin Nikolay A Semina Svetlana E Generozov Edward V Govorun Vadim M 30 listopada 2015 Isolation of exosomes by differential centrifugation Theoretical analysis of a commonly used protocol Scientific Reports angl 5 1 17319 Bibcode 2015NatSR 517319L doi 10 1038 srep17319 ISSN 2045 2322 PMC 4663484 PMID 26616523 S2CID 14200669 Harding Stephen E Scott David Rowe Arther 16 grudnya 2007 Analytical Ultracentrifugation Techniques and Methods angl Royal Society of Chemistry ISBN 978 1 84755 261 7 Frei Mark Centrifugation Separations BioFiles 6 5 6 7 Taylor Douglas D Shah Sahil 1 zhovtnya 2015 Methods of isolating extracellular vesicles impact down stream analyses of their cargoes Methods 87 3 10 doi 10 1016 j ymeth 2015 02 019 PMID 25766927 Yu Li Li Zhu Jing Liu Jin Xia Jiang Feng Ni Wen Kai Qu Li Shuai Ni Run Zhou Lu Cui Hua Xiao Ming Bing 2018 A Comparison of Traditional and Novel Methods for the Separation of Exosomes from Human Samples BioMed Research International angl 2018 1 9 doi 10 1155 2018 3634563 PMC 6083592 PMID 30148165