Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
Нозерн-блоттинг — молекулярно-генетичний метод, який використовується для перенесення (блотингу) РНК, розділеної за допомогою гель-електрофорезу, на мембрану. Послідовності РНК можуть бути специфічно позначені на мембрані шляхом гібридизації з комплементарними генними зондами.
Історія методу
Нозерн-блоттинг є різновидом методу Саузерн-блоттингу, методу, що використовується для виявлення послідовностей геномної ДНК, названого на честь його винахідника Едварда Саузерна. Нозерн-блотінг був розроблений Джеймсом Алвіном, Девідом Кемпом і Джорджем Старком у 1977 році. Оригінальний метод Нозерн був громіздким і вимагав спеціально підготовлених мембран для перенесення РНК з гелю. Патриція Томас адаптувала процедуру для використання з комерційно доступними мембранами, що дозволило широко використовувати технологію.
Загальна характеристика
Техніка Нозерн-блоттингу виявляє кількість і розмір РНК, дає уявлення про рівні експресії певного гена в тканині або варіанти сплайсингу. Принцип Нозерн-блоттингу заснований на властивості комплементарних ланцюгів РНК і/або ДНК утворювати стабільні гібридизовані комплекси за допомогою сполучення основ Вотсона–Кріка за температури навколишнього середовища. Нозерн-блоттинг зазвичай починається з виділення і розділення РНК за розміром за допомогою електрофорезу, відокремленої РНК з гелю на нейлонову мембрану та гібридизації зонду до РНК-інтересу з подальшим виявленням гібридизованого комплексу .
Спочатку використовується денатуруючий гель для розділення РНК за розміром. Потім РНК переноситься на нейлонову мембрану, зберігаючи той самий розподіл у гелі. Після фіксації РНК до мембрани мічений зонд,який є комплементарним гену-інтересу, додають для гібридизації з іммобілізованою РНК. Неспецифічно зв'язані зонди змиваються. Мембрану з зондом висушують, експонують і аналізують. За допомгою цієї методики можна не лише визначити кількість, але й розміри транскриптів. Однак, якщо кількість загальної РНК для експерименту обмежена, а рівень експресії цікавого транскрипту низький, можна використовувати інші методи, наприклад, кількісна RT-PCR .
Останнім часом були розроблені нерадіоактивні методи виявлення ДНК і РНК. Найпоширенішими мітками є «дигоксигенін», «флуоресцеїн» і «біотин», які з’єднані через спейсер із нуклеотидом (у більшості випадків UTP або dUTP) і включені в конкретні генні зонди різними методами. Виявлення базується на специфічній взаємодії міток з відповідними білками, тобто специфічними антидигоксигеніновими та антифлуоресцеїновими антитілами або (стрепт)авідином, кон’югованими з лужною фосфатазою або пероксидазою. Розробка хемілюмінесцентних субстратів (наприклад, CSPD, CPD, CPD-Star від Troptx) покращила чутливість виявлення. Лінійний діапазон інтенсивності сигналу в основному залежить від двох факторів: розміру зонда (кількості вбудованих міток) і часу освітлення рентгенівських плівок. Коли зонди, мічені біотином, синтезуються за допомогою ПЛР, температура відпалу залежить від послідовності (послідовностей) праймера та довжини продукту .
Перед використанням для блоттів чутливість зонда необхідно визначити за допомогою слот-блоту. Більші концентрації зонда дозволяють скоротити час гібридизації. Однак це також призведе до підвищення фону. Якщо концентрація зонда низька, то неоюхвдний довший період гібридизації, щоб отримати однакову силу сигналу. Сильний фон, спричинений неспецифічним зв’язуванням зонда, можна зменшити за допомогою обробки РНКазою А після гібридизації. Як альтернативу можна модифікувати параметри гібридизації та промивання.
Довідкова інформація
Термін Нозерн-блот, який спочатку використовувався в жартівливій манері, став закріпленим у жаргоні молекулярної біології. Нозерн-гібридизація є стандартною процедурою для ідентифікації та аналізу розміру транскриптів РНК, а РНК-слот-блоттинг часто використовується для оцінки профілів експресії тканиноспецифічних генів. Ідентифікація специфічних мРНК може бути використана для оцінки природи окремих популяцій клітин і ступінь активації або диференціації клітин .
Основна відмінність між Саузен і Нозерн-блоттингом полягає в початковій стадії фракціонування гелю. Оскільки одноланцюгова РНК може утворювати вторинні структури, зразки повинні бути піддані електрофорезу в умовах денатурації, щоб забезпечити гарне розділення. Використовувалися різноманітні денатуранти для РНК-гелів, включаючи формальдегід, гліоксаль/ДМСО та високотоксичний метилртутний хлорид. Через значні ризики для здоров'я використання метилртуті хлорид не рекомендується. Рекомендуються формальдегідні гелі, оскільки вони прості у використанні та досить надійні. Загальну клітинну РНК або полі(А)+ РНК можна використовувати для Нозерн-перенесення та слот-блотів. Загальна РНК є менш задовільною .
Підготовка необхідних матеріалів та обладнання
Скляний посуд слід силіконізувати, змочити в 0,2% ДЕПК протягом 1 години, а потім стерилізувати при 180°C протягом 2 годин. Пластикові гелеві лотки та інші матеріали слід замочити в 0,1% DEPC на 1 годину та промити стерильною водою, обробленою DEPC перед використанням. Розчини слід обробити DEPC перед автоклавуванням. DEPC є токсичним, і з ним слід поводитися обережно. Усі використовувані хімікати мають бути класу AnaIaR . Для інгібування активності РНКази всі розчини для Нозерн-блоттингу слід готувати з використанням стерильної деіонізованої води, обробленої діетилпірокарбонатом (DEPC) .
Через реакційноздатну амінну групу буфери Tris-HCl непридатні для використання при використанні формальдегіду як денатуранта. Концентрація РНК повинна бути така, щоб, навіть після п’ятикратного розведення буфером для зразків, її можна було легко завантажувати гель. Нейлонові мембрани, придатні для використання, включають як незаряджені мембрани, такі як Hybond N, так і заряджені мембрани, такі як Hybond N+. Мембрани з нітроцелюлози та полівінілідену (PVDF) непридатні для використання з системою дигоксигенін/AMPPD. Також важливо, щоб розчини для змочування та перенесення мембрани були стерильними .
Виділення та розділення РНК за розміром за допомогою електрофорезу
Електрофорез РНК через агарозний гель для блотування вимагає повної денатурації РНК. Було використано ряд денатурантів, включаючи гліоксаль і диметилсульфоксид (I), гідроксид метилртуті і формальдегід. Буферна система MOPS, на відміну від Tris-HCl, підходить для використання з формальдегідом. РНК переноситься на нейлонову мембрану капілярним блоттингом для подальшої гібридизації .
Виділення РНК із зразків тканини або культивованих клітин можна здійснити за допомогою комерційних наборів, хаотропних реагентів або диференціального осадження нуклеїнових кислот, яке відокремлює РНК від ДНК і білків. Загальна РНК включає рибосомну РНК (рРНК), транспортну РНК (тРНК), групу малих РНК, включаючи мікроРНК, і широкий діапазон розмірів різних мРНК. Для Нозерн-аналізу необхідно відокремити окремі види РНК від загальної РНК фракціонуванням за розміром. Фракціонування за розміром можна легко виконати за допомогою електрофорезу. На відміну від білків, які можуть мати позитивні, негативні або нейтральні сумарні електричні заряди, фосфатний каркас РНК сприяє створенню сумарного негативного заряду макромолекули РНК, пропорційного довжині РНК. Чистий негативний заряд спонукатиме міграцію молекул РНК до анода. Однак гелева матриця складається з поперечно-зшитих полімерів, які перешкоджатимуть вільній міграції макромолекул РНК, що призведе до сповільнення міграції. Таким чином, більші молекули рухатимуться до анода повільніше, ніж менші молекули. Якщо метою Нозерн-блоттингу є виявлення РНК певного розміру, загальну РНК необхідно денатурувати та піддати електрофорезу на денатуруючому гелі, щоб РНК залишалася денатурованою. Це необхідно, оскільки одноланцюгова РНК має тенденцію утворювати внутрішньомолекулярні пари основ, а вторинна та третинна структури можуть змінювати швидкість міграції РНК шляхом зміни розподілу заряду та гідродинамічного об’єму .
Гібридизація комплементарного зонда з РНК
Комплементарні олігонуклеотиди демонструють дуже високу та специфічну афінність зв’язування. Це найбільш специфічна реакція в молекулярній біології, і її можна контролювати таким чином, щоб можна було виявити навіть невідповідність одного нуклеотиду між двома аннелюваними нуклеїновими кислотами. Ця властивість гібридизації між парами основ використовується в Нозерн-блоттингу для виявлення РНК-інетресу. Після того, як розділену за розміром РНК іммобілізують на мембрані, наступним кроком є виявлення РНК за допомогою нуклеотидного зонду, як правило, комплементарної ДНК (кДНК). При створенні зонда важливо враховувати, в яких областях він зв’язує цільову РНК. Наприклад, більшість мРНК мають ділянки, які присутні у всіх постсплайсованих варіантах; однак деякі мРНК мають альтернативні сплайсовані екзони, які можуть бути присутніми не у всіх транскриптах. Довжина зонда може варіюватися від 25 нуклеотидів до кількох тисяч основ. Якщо використовуються дуже довгі зонди, важливо враховувати, що може статися часткове зв’язування зонда. При розробці зонда також важливо враховувати, чи буде зонд націлений на ділянку, специфічну для цільової РНК, оскільки інші РНК можуть мати ідентичні або частково ідентичні послідовності. Щоб перевірити це, можна виконати пошук у базі даних, щоб переконатися, що вся послідовність зонду є унікальною для мРНК-інтересу .
Етап гібридизації починається з попередньої гібридизації мембрани в блокуючому розчині, який містить неспецифічні молекули, які зв’язуються з усіма реактивними ділянками на мембрані, які ще не зайняті РНК. Після попередньої гібридизації мембрану заливають розчином для гібридизації, який містить відповідний зонд, і починається гібридизація. Цей етап зазвичай виконується при температурі, оптимальній для гібридизації між зондом і РНК. Щоб виявити гібридизацію, зонд можна позначити радіоактивним способом, щоб можна було візуалізувати сигнал гібридизації за допомогою системи фосфоілюстрації. Крім того, зонд може бути виготовлений з міткою, яка дозволяє виявити антитіла. Антитіло проти дигоксигеніну попередньо кон’югують з ферментом. Важливо відзначити, що нозерн-блоттинг виявляє гібридизацію між зондом і його комплементарним ланцюгом .
Інтерпретація результатів Нозерн-блоттингу
При інтерпретації результату Нозерн-блоту слід враховувати кілька моментів. Якщо розмір і кількість виявлених смуг не такі, як очікувалося, це може бути спричинено такими проблемами: важливо переконатися, що зонд є специфічним лише для РНК-інтересу. Також важливо розглянути, з якою областю РНК зв’язується зонд і чи є ця область частиною альтернативного екзону, чи інші частини РНК мають альтернативні екзони. Якщо смуги не виявляються, кількість РНК-інтересу може бути нижче межі виявлення. Можна збільшити межу виявлення за допомогою колонок Poly-T+. Оскільки лише 3% загальної РНК становить мРНК, очищення збільшить межу виявлення приблизно в 30 разів .
Розділення РНК шляхом електрофорезу в денатуруючому агарозному гелі
Додати 1.8г агарози до 150мл 1хМОПС буперу, розчинити, охолодити до комофртної для тримання у руці температури, додати 2.8мл формальдегіду, залити розчин в камеру. Після застигання, додати буфер та залишити на 30хв. Змішати 15гр РНК з рівним об’ємом РНК-буферу. Змішати 3гр РНК-маркеру з рівним об’ємом РНК-буферу, нагріти до 65 градусів на 12-15хв, залишити на льодяній бані. Залишити гель 125 Вольт, 3 год .
Об’єм зразка не повинен перевищувати об’єм лунки з гелем. Якщо зразок РНК занадто розведений, осадіити РНК етанолом і ресуспендуйте її в меншому об’ємі води .
Перенесення РНК з гелю на нейлонову мембрану
Розрізати нейлонову мембрану за розміром гелю денатуруючої РНК. Вирізати шматок ватману 3 мм такого ж розміру, як і нейлонова мембрана. Промити гель водою. Заповнити лунки гелю агарозою. Змочити нейлонову мембрану та ватман спочатку у воді, а потім у 10xSSC. Помістити вологий фільтрувальний папір на пористий вакуумний столик. Покласти зволожену нейлонову мембрану на фільтрувальний папір. Переконатися, що між мембраною та фільтром немає бульбашок повітря. Помістити пластикову прокладку поверх мембрани/фільтрувального паперу. Обережно помістити гель поверх прокладки лунками догори. Видалити усі бульбашки повітря між гелем і нейлоновою мембраною. Обережно залити 1 л 10 SSC у резервуар. Коли перенесення закінчиться, зняти ущільнювальну рамку та злити буфер. Зняти гель і вийняти нейлонову мембрану. Висушити нейлонову мембрану між двома листами фільтрувального паперу. Гель можна опромінити ультрафіолетовим світлом, щоб перевірити, чи залишилася РНК у гелі після перенесення .
Гібридизація зонда з мембраною
Додати 10 мл буфера для гібридизації. Попередньо прегібридизувати при 68°С протягом 1 години в гібридизаційній печі. Гібридизувати при 68 С протягом ночі. Попередньо нагріті промивні буфери до 68 C. Зняти мембрану та просушити її на серветці. Загорнути мембрану з поліетиленовою плівкою та виставити на ніч на люмінофорному екрані. Проаналізуйте зображення за допомогою програмного забезпечення ImageQuant .
- Lovatt, D.; Eberwine, J. (2013). Northern Blotting. Brenner's Encyclopedia of Genetics (англ.). Elsevier. с. 105—107. doi:10.1016/b978-0-12-374984-0.01065-2. ISBN .
- He, Shan L.; Green, Rachel (2013). Northern Blotting. Methods in Enzymology (англ.). Т. 530. Elsevier. с. 75—87. doi:10.1016/b978-0-12-420037-1.00003-8. ISBN . PMC 4287216. PMID 24034315.
{{}}: Обслуговування CS1: Сторінки з PMC з іншим форматом () - Löw, Rainer (1998). Rapley, Ralph; Manning, David L. (ред.). Nonradioactive Northern Blotting. RNA Isolation and Characterization Protocols. Totowa, NJ: Humana Press. с. 77—86. doi:10.1385/0-89603-494-1:77. ISBN .
- Hodge, Rachel (29 листопада 1993). Preparation of RNA Gel Blots. Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes (англ.). Т. 28. New Jersey: Humana Press. с. 49—54. doi:10.1385/0-89603-254-x:49. ISBN .
- Brown, Terry (1993-09). Analysis of RNA by Northern and Slot‐Blot Hybridization. Current Protocols in Immunology (англ.). Т. 7, № 1. doi:10.1002/0471142735.im1012s07. ISSN 1934-3671. Процитовано 1 листопада 2022.
- Lovatt, D.; Eberwine, J. (2013). Northern Blotting. Brenner's Encyclopedia of Genetics (англ.). Elsevier. с. 105—107. doi:10.1016/b978-0-12-374984-0.01065-2. ISBN .
Вікіпедія, Українська, Україна, книга, книги, бібліотека, стаття, читати, завантажити, безкоштовно, безкоштовно завантажити, mp3, відео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, малюнок, музика, пісня, фільм, книга, гра, ігри, мобільний, телефон, android, ios, apple, мобільний телефон, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Інтернет
Nozern blotting molekulyarno genetichnij metod yakij vikoristovuyetsya dlya perenesennya blotingu RNK rozdilenoyi za dopomogoyu gel elektroforezu na membranu Poslidovnosti RNK mozhut buti specifichno poznacheni na membrani shlyahom gibridizaciyi z komplementarnimi gennimi zondami Istoriya metoduNozern blotting ye riznovidom metodu Sauzern blottingu metodu sho vikoristovuyetsya dlya viyavlennya poslidovnostej genomnoyi DNK nazvanogo na chest jogo vinahidnika Edvarda Sauzerna Nozern bloting buv rozroblenij Dzhejmsom Alvinom Devidom Kempom i Dzhordzhem Starkom u 1977 roci Originalnij metod Nozern buv gromizdkim i vimagav specialno pidgotovlenih membran dlya perenesennya RNK z gelyu Patriciya Tomas adaptuvala proceduru dlya vikoristannya z komercijno dostupnimi membranami sho dozvolilo shiroko vikoristovuvati tehnologiyu Zagalna harakteristikaTehnika Nozern blottingu viyavlyaye kilkist i rozmir RNK daye uyavlennya pro rivni ekspresiyi pevnogo gena v tkanini abo varianti splajsingu Princip Nozern blottingu zasnovanij na vlastivosti komplementarnih lancyugiv RNK i abo DNK utvoryuvati stabilni gibridizovani kompleksi za dopomogoyu spoluchennya osnov Votsona Krika za temperaturi navkolishnogo seredovisha Nozern blotting zazvichaj pochinayetsya z vidilennya i rozdilennya RNK za rozmirom za dopomogoyu elektroforezu vidokremlenoyi RNK z gelyu na nejlonovu membranu ta gibridizaciyi zondu do RNK interesu z podalshim viyavlennyam gibridizovanogo kompleksu Spochatku vikoristovuyetsya denaturuyuchij gel dlya rozdilennya RNK za rozmirom Potim RNK perenositsya na nejlonovu membranu zberigayuchi toj samij rozpodil u geli Pislya fiksaciyi RNK do membrani michenij zond yakij ye komplementarnim genu interesu dodayut dlya gibridizaciyi z immobilizovanoyu RNK Nespecifichno zv yazani zondi zmivayutsya Membranu z zondom visushuyut eksponuyut i analizuyut Za dopomgoyu ciyeyi metodiki mozhna ne lishe viznachiti kilkist ale j rozmiri transkriptiv Odnak yaksho kilkist zagalnoyi RNK dlya eksperimentu obmezhena a riven ekspresiyi cikavogo transkriptu nizkij mozhna vikoristovuvati inshi metodi napriklad kilkisna RT PCR Ostannim chasom buli rozrobleni neradioaktivni metodi viyavlennya DNK i RNK Najposhirenishimi mitkami ye digoksigenin fluoresceyin i biotin yaki z yednani cherez spejser iz nukleotidom u bilshosti vipadkiv UTP abo dUTP i vklyucheni v konkretni genni zondi riznimi metodami Viyavlennya bazuyetsya na specifichnij vzayemodiyi mitok z vidpovidnimi bilkami tobto specifichnimi antidigoksigeninovimi ta antifluoresceyinovimi antitilami abo strept avidinom kon yugovanimi z luzhnoyu fosfatazoyu abo peroksidazoyu Rozrobka hemilyuminescentnih substrativ napriklad CSPD CPD CPD Star vid Troptx pokrashila chutlivist viyavlennya Linijnij diapazon intensivnosti signalu v osnovnomu zalezhit vid dvoh faktoriv rozmiru zonda kilkosti vbudovanih mitok i chasu osvitlennya rentgenivskih plivok Koli zondi micheni biotinom sintezuyutsya za dopomogoyu PLR temperatura vidpalu zalezhit vid poslidovnosti poslidovnostej prajmera ta dovzhini produktu Pered vikoristannyam dlya blottiv chutlivist zonda neobhidno viznachiti za dopomogoyu slot blotu Bilshi koncentraciyi zonda dozvolyayut skorotiti chas gibridizaciyi Odnak ce takozh prizvede do pidvishennya fonu Yaksho koncentraciya zonda nizka to neoyuhvdnij dovshij period gibridizaciyi shob otrimati odnakovu silu signalu Silnij fon sprichinenij nespecifichnim zv yazuvannyam zonda mozhna zmenshiti za dopomogoyu obrobki RNKazoyu A pislya gibridizaciyi Yak alternativu mozhna modifikuvati parametri gibridizaciyi ta promivannya Dovidkova informaciyaTermin Nozern blot yakij spochatku vikoristovuvavsya v zhartivlivij maneri stav zakriplenim u zhargoni molekulyarnoyi biologiyi Nozern gibridizaciya ye standartnoyu proceduroyu dlya identifikaciyi ta analizu rozmiru transkriptiv RNK a RNK slot blotting chasto vikoristovuyetsya dlya ocinki profiliv ekspresiyi tkaninospecifichnih geniv Identifikaciya specifichnih mRNK mozhe buti vikoristana dlya ocinki prirodi okremih populyacij klitin i stupin aktivaciyi abo diferenciaciyi klitin Osnovna vidminnist mizh Sauzen i Nozern blottingom polyagaye v pochatkovij stadiyi frakcionuvannya gelyu Oskilki odnolancyugova RNK mozhe utvoryuvati vtorinni strukturi zrazki povinni buti piddani elektroforezu v umovah denaturaciyi shob zabezpechiti garne rozdilennya Vikoristovuvalisya riznomanitni denaturanti dlya RNK geliv vklyuchayuchi formaldegid glioksal DMSO ta visokotoksichnij metilrtutnij hlorid Cherez znachni riziki dlya zdorov ya vikoristannya metilrtuti hlorid ne rekomenduyetsya Rekomenduyutsya formaldegidni geli oskilki voni prosti u vikoristanni ta dosit nadijni Zagalnu klitinnu RNK abo poli A RNK mozhna vikoristovuvati dlya Nozern perenesennya ta slot blotiv Zagalna RNK ye mensh zadovilnoyu Pidgotovka neobhidnih materialiv ta obladnannyaSklyanij posud slid silikonizuvati zmochiti v 0 2 DEPK protyagom 1 godini a potim sterilizuvati pri 180 C protyagom 2 godin Plastikovi gelevi lotki ta inshi materiali slid zamochiti v 0 1 DEPC na 1 godinu ta promiti sterilnoyu vodoyu obroblenoyu DEPC pered vikoristannyam Rozchini slid obrobiti DEPC pered avtoklavuvannyam DEPC ye toksichnim i z nim slid povoditisya oberezhno Usi vikoristovuvani himikati mayut buti klasu AnaIaR Dlya ingibuvannya aktivnosti RNKazi vsi rozchini dlya Nozern blottingu slid gotuvati z vikoristannyam sterilnoyi deionizovanoyi vodi obroblenoyi dietilpirokarbonatom DEPC Cherez reakcijnozdatnu aminnu grupu buferi Tris HCl nepridatni dlya vikoristannya pri vikoristanni formaldegidu yak denaturanta Koncentraciya RNK povinna buti taka shob navit pislya p yatikratnogo rozvedennya buferom dlya zrazkiv yiyi mozhna bulo legko zavantazhuvati gel Nejlonovi membrani pridatni dlya vikoristannya vklyuchayut yak nezaryadzheni membrani taki yak Hybond N tak i zaryadzheni membrani taki yak Hybond N Membrani z nitrocelyulozi ta polivinilidenu PVDF nepridatni dlya vikoristannya z sistemoyu digoksigenin AMPPD Takozh vazhlivo shob rozchini dlya zmochuvannya ta perenesennya membrani buli sterilnimi Vidilennya ta rozdilennya RNK za rozmirom za dopomogoyu elektroforezuElektroforez RNK cherez agaroznij gel dlya blotuvannya vimagaye povnoyi denaturaciyi RNK Bulo vikoristano ryad denaturantiv vklyuchayuchi glioksal i dimetilsulfoksid I gidroksid metilrtuti i formaldegid Buferna sistema MOPS na vidminu vid Tris HCl pidhodit dlya vikoristannya z formaldegidom RNK perenositsya na nejlonovu membranu kapilyarnim blottingom dlya podalshoyi gibridizaciyi Vidilennya RNK iz zrazkiv tkanini abo kultivovanih klitin mozhna zdijsniti za dopomogoyu komercijnih naboriv haotropnih reagentiv abo diferencialnogo osadzhennya nukleyinovih kislot yake vidokremlyuye RNK vid DNK i bilkiv Zagalna RNK vklyuchaye ribosomnu RNK rRNK transportnu RNK tRNK grupu malih RNK vklyuchayuchi mikroRNK i shirokij diapazon rozmiriv riznih mRNK Dlya Nozern analizu neobhidno vidokremiti okremi vidi RNK vid zagalnoyi RNK frakcionuvannyam za rozmirom Frakcionuvannya za rozmirom mozhna legko vikonati za dopomogoyu elektroforezu Na vidminu vid bilkiv yaki mozhut mati pozitivni negativni abo nejtralni sumarni elektrichni zaryadi fosfatnij karkas RNK spriyaye stvorennyu sumarnogo negativnogo zaryadu makromolekuli RNK proporcijnogo dovzhini RNK Chistij negativnij zaryad sponukatime migraciyu molekul RNK do anoda Odnak geleva matricya skladayetsya z poperechno zshitih polimeriv yaki pereshkodzhatimut vilnij migraciyi makromolekul RNK sho prizvede do spovilnennya migraciyi Takim chinom bilshi molekuli ruhatimutsya do anoda povilnishe nizh menshi molekuli Yaksho metoyu Nozern blottingu ye viyavlennya RNK pevnogo rozmiru zagalnu RNK neobhidno denaturuvati ta piddati elektroforezu na denaturuyuchomu geli shob RNK zalishalasya denaturovanoyu Ce neobhidno oskilki odnolancyugova RNK maye tendenciyu utvoryuvati vnutrishnomolekulyarni pari osnov a vtorinna ta tretinna strukturi mozhut zminyuvati shvidkist migraciyi RNK shlyahom zmini rozpodilu zaryadu ta gidrodinamichnogo ob yemu Gibridizaciya komplementarnogo zonda z RNKKomplementarni oligonukleotidi demonstruyut duzhe visoku ta specifichnu afinnist zv yazuvannya Ce najbilsh specifichna reakciya v molekulyarnij biologiyi i yiyi mozhna kontrolyuvati takim chinom shob mozhna bulo viyaviti navit nevidpovidnist odnogo nukleotidu mizh dvoma annelyuvanimi nukleyinovimi kislotami Cya vlastivist gibridizaciyi mizh parami osnov vikoristovuyetsya v Nozern blottingu dlya viyavlennya RNK inetresu Pislya togo yak rozdilenu za rozmirom RNK immobilizuyut na membrani nastupnim krokom ye viyavlennya RNK za dopomogoyu nukleotidnogo zondu yak pravilo komplementarnoyi DNK kDNK Pri stvorenni zonda vazhlivo vrahovuvati v yakih oblastyah vin zv yazuye cilovu RNK Napriklad bilshist mRNK mayut dilyanki yaki prisutni u vsih postsplajsovanih variantah odnak deyaki mRNK mayut alternativni splajsovani ekzoni yaki mozhut buti prisutnimi ne u vsih transkriptah Dovzhina zonda mozhe variyuvatisya vid 25 nukleotidiv do kilkoh tisyach osnov Yaksho vikoristovuyutsya duzhe dovgi zondi vazhlivo vrahovuvati sho mozhe statisya chastkove zv yazuvannya zonda Pri rozrobci zonda takozh vazhlivo vrahovuvati chi bude zond nacilenij na dilyanku specifichnu dlya cilovoyi RNK oskilki inshi RNK mozhut mati identichni abo chastkovo identichni poslidovnosti Shob pereviriti ce mozhna vikonati poshuk u bazi danih shob perekonatisya sho vsya poslidovnist zondu ye unikalnoyu dlya mRNK interesu Etap gibridizaciyi pochinayetsya z poperednoyi gibridizaciyi membrani v blokuyuchomu rozchini yakij mistit nespecifichni molekuli yaki zv yazuyutsya z usima reaktivnimi dilyankami na membrani yaki she ne zajnyati RNK Pislya poperednoyi gibridizaciyi membranu zalivayut rozchinom dlya gibridizaciyi yakij mistit vidpovidnij zond i pochinayetsya gibridizaciya Cej etap zazvichaj vikonuyetsya pri temperaturi optimalnij dlya gibridizaciyi mizh zondom i RNK Shob viyaviti gibridizaciyu zond mozhna poznachiti radioaktivnim sposobom shob mozhna bulo vizualizuvati signal gibridizaciyi za dopomogoyu sistemi fosfoilyustraciyi Krim togo zond mozhe buti vigotovlenij z mitkoyu yaka dozvolyaye viyaviti antitila Antitilo proti digoksigeninu poperedno kon yuguyut z fermentom Vazhlivo vidznachiti sho nozern blotting viyavlyaye gibridizaciyu mizh zondom i jogo komplementarnim lancyugom Interpretaciya rezultativ Nozern blottinguPri interpretaciyi rezultatu Nozern blotu slid vrahovuvati kilka momentiv Yaksho rozmir i kilkist viyavlenih smug ne taki yak ochikuvalosya ce mozhe buti sprichineno takimi problemami vazhlivo perekonatisya sho zond ye specifichnim lishe dlya RNK interesu Takozh vazhlivo rozglyanuti z yakoyu oblastyu RNK zv yazuyetsya zond i chi ye cya oblast chastinoyu alternativnogo ekzonu chi inshi chastini RNK mayut alternativni ekzoni Yaksho smugi ne viyavlyayutsya kilkist RNK interesu mozhe buti nizhche mezhi viyavlennya Mozhna zbilshiti mezhu viyavlennya za dopomogoyu kolonok Poly T Oskilki lishe 3 zagalnoyi RNK stanovit mRNK ochishennya zbilshit mezhu viyavlennya priblizno v 30 raziv Rozdilennya RNK shlyahom elektroforezu v denaturuyuchomu agaroznomu geliDodati 1 8g agarozi do 150ml 1hMOPS buperu rozchiniti oholoditi do komofrtnoyi dlya trimannya u ruci temperaturi dodati 2 8ml formaldegidu zaliti rozchin v kameru Pislya zastigannya dodati bufer ta zalishiti na 30hv Zmishati 15gr RNK z rivnim ob yemom RNK buferu Zmishati 3gr RNK markeru z rivnim ob yemom RNK buferu nagriti do 65 gradusiv na 12 15hv zalishiti na lodyanij bani Zalishiti gel 125 Volt 3 god Ob yem zrazka ne povinen perevishuvati ob yem lunki z gelem Yaksho zrazok RNK zanadto rozvedenij osadiiti RNK etanolom i resuspendujte yiyi v menshomu ob yemi vodi Perenesennya RNK z gelyu na nejlonovu membranuRozrizati nejlonovu membranu za rozmirom gelyu denaturuyuchoyi RNK Virizati shmatok vatmanu 3 mm takogo zh rozmiru yak i nejlonova membrana Promiti gel vodoyu Zapovniti lunki gelyu agarozoyu Zmochiti nejlonovu membranu ta vatman spochatku u vodi a potim u 10xSSC Pomistiti vologij filtruvalnij papir na poristij vakuumnij stolik Poklasti zvolozhenu nejlonovu membranu na filtruvalnij papir Perekonatisya sho mizh membranoyu ta filtrom nemaye bulbashok povitrya Pomistiti plastikovu prokladku poverh membrani filtruvalnogo paperu Oberezhno pomistiti gel poverh prokladki lunkami dogori Vidaliti usi bulbashki povitrya mizh gelem i nejlonovoyu membranoyu Oberezhno zaliti 1 l 10 SSC u rezervuar Koli perenesennya zakinchitsya znyati ushilnyuvalnu ramku ta zliti bufer Znyati gel i vijnyati nejlonovu membranu Visushiti nejlonovu membranu mizh dvoma listami filtruvalnogo paperu Gel mozhna oprominiti ultrafioletovim svitlom shob pereviriti chi zalishilasya RNK u geli pislya perenesennya Gibridizaciya zonda z membranoyuDodati 10 ml bufera dlya gibridizaciyi Poperedno pregibridizuvati pri 68 S protyagom 1 godini v gibridizacijnij pechi Gibridizuvati pri 68 S protyagom nochi Poperedno nagriti promivni buferi do 68 C Znyati membranu ta prosushiti yiyi na servetci Zagornuti membranu z polietilenovoyu plivkoyu ta vistaviti na nich na lyuminofornomu ekrani Proanalizujte zobrazhennya za dopomogoyu programnogo zabezpechennya ImageQuant Lovatt D Eberwine J 2013 Northern Blotting Brenner s Encyclopedia of Genetics angl Elsevier s 105 107 doi 10 1016 b978 0 12 374984 0 01065 2 ISBN 978 0 08 096156 9 He Shan L Green Rachel 2013 Northern Blotting Methods in Enzymology angl T 530 Elsevier s 75 87 doi 10 1016 b978 0 12 420037 1 00003 8 ISBN 978 0 12 420037 1 PMC 4287216 PMID 24034315 a href wiki D0 A8 D0 B0 D0 B1 D0 BB D0 BE D0 BD Cite book title Shablon Cite book cite book a Obslugovuvannya CS1 Storinki z PMC z inshim formatom posilannya Low Rainer 1998 Rapley Ralph Manning David L red Nonradioactive Northern Blotting RNA Isolation and Characterization Protocols Totowa NJ Humana Press s 77 86 doi 10 1385 0 89603 494 1 77 ISBN 978 0 89603 494 5 Hodge Rachel 29 listopada 1993 Preparation of RNA Gel Blots Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes angl T 28 New Jersey Humana Press s 49 54 doi 10 1385 0 89603 254 x 49 ISBN 978 0 89603 254 5 Brown Terry 1993 09 Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization Current Protocols in Immunology angl T 7 1 doi 10 1002 0471142735 im1012s07 ISSN 1934 3671 Procitovano 1 listopada 2022 Lovatt D Eberwine J 2013 Northern Blotting Brenner s Encyclopedia of Genetics angl Elsevier s 105 107 doi 10 1016 b978 0 12 374984 0 01065 2 ISBN 978 0 08 096156 9