Кометний аналіз (одноклітинний гель-електрофорез) — техніка гель-електрофорезу, яка дає змогу виявити пошкодження ДНК в окремих клітинах. Метод був розроблений у 1984 році Остлінгом і Йохансоном для виявлення дволанцюгових розривів ДНК . З подальшою розробкою Сінгха в 1988 році одноланцюгові розриви ДНК також можна виявити за допомогою базових буферів. Принцип кометного аналізу полягає в тому, що клітини, вбудовані в агарозу, лізують і піддають дії електричного поля, відомого як електрофорез. Інкапсуляція клітин у суспензії агарози відбувається при низькій температурі, лізис клітин - у нейтральних або лужних (pH>13) умовах. Термін «комета» виник через міграцію ДНК під час гель-електрофорезу, яка часто нагадує комету . Під час електрофорезу негативно заряджена ДНК мігрує до позитивного полюса, і завдяки порам в агарозі фрагменти розділяються відповідно до розміру, оскільки менші фрагменти долають більшу відстань, ніж більші за певний час. Однак хромосомна ДНК занадто велика, щоб мігрувати як ціле в електричному полі. Тільки пошкоджена, фрагментарна ДНК здатна мігрувати з клітинного ядра. В ультрафіолетовому мікроскопі видно пошкоджені клітини, які попередньо були , такими як бромід етидію тепер із хвостом із фрагментів ДНК, що надає їм вигляду комети. Будь-яка клітина, яка має ядро, може бути використана в кометному аналізі. Виконання кометного аналізу відносно просте та швидке. Оцінюють кількість пошкоджених і непошкоджених клітинних ядер ручним способом або за допомогою спеціальних комп’ютерних програм з візуальним записом.
Процедура
- Інкапсуляція
Зразок клітин, отриманий з клітинної культури in vitro або досліджуваного in vivo (), диспергують на окремі клітини та суспензують у розплавленій агарозі з низькою температурою плавлення при 37 °C. Ця моносуспензія відливається на предметному склі мікроскопа. Покривне шкельце тримають під кутом і наносять моносуспензію на цятку контакту між покривним і предметним стеклами. Коли покривне скло опускається на предметне, розплавлена агароза розтікається, утворюючи тонкий шар. Агароза гелюється при 4 °C і покривне шкельце видаляється. Агароза утворює матрицю вуглеводних волокон, які інкапсулюють клітини, закріплюючи їх. Агароза вважається осмотично нейтральною, тому розчини можуть проникати в гель і діяти на клітини без зміни положення клітин. У дослідженні in vitro клітини будуть піддані дії тестового агента (ультрафіолетового світла, іонізуючого випромінювання або генотоксичних хімікатів) для індукції пошкодження ДНК в інкапсульованих клітинах. Для калібрування зазвичай використовується перекис водню, щоб отримати стандартизований рівень пошкодження ДНК .
- Лізис
Потім предметне скло занурюють у розчин, який викликає лізис клітин. Лізисний розчин, який часто використовують у кометному аналізі, складається з висококонцентрованого водного розчину солі (часто можна використовувати звичайну кухонну сіль) і миючого засобу (наприклад, Triton X-100 або саркозинат). Рівень pH розчину для лізису можна регулювати зазвичай між нейтральним і лужним, залежно від типу пошкодження, яке досліджується. Водний розчин солі порушує білки та їх схеми зв’язування всередині клітини, а також порушує вміст РНК у клітині. Миючий засіб розчиняє клітинні мембрани. Під дією розчину для лізису клітини руйнуються. Усі білки, РНК, мембрани, цитоплазматичні та нуклеоплазматичні компоненти руйнуються. Залишається лише ДНК клітини, яка розплутується, щоб заповнити порожнину в агарозі, яку заповнювала вся клітина. Ця структура називається нуклеоїдом (загальний термін для структури, в якій зосереджена ДНК).
- Електрофорез
Після лізису клітин (зазвичай 1–2 години при 4 °C) предметні стекла промивають дистильованою водою для видалення всіх солей і занурюють у другий розчин – розчин для електрофорезу. рН цього розчину можна регулювати залежно від типу пошкодження, яке досліджується. Шкельця залишають на ~20 хвилин у розчині для електрофорезу перед застосуванням електричного поля. У лужних умовах подвійна спіраль ДНК денатурується, нуклеоїд стає одноланцюговим. Пропускається електричне поле (зазвичай 1 вольт/см) протягом ~20 хвилин. Потім шкельця нейтралізують до рН 7, фарбують специфічною для ДНК та аналізують за допомогою мікроскопа з приєднаним пристроєм із зарядовим зв’язком (цифровою камерою), який під'єднаний до комп’ютера з програмним забезпеченням для аналізу зображень.
Структура аналізу
Концепція, яка лежить в основі кометного аналізу, полягає в тому, що непошкоджена ДНК зберігає високоорганізований зв’язок з матричними білками в ядрі. При пошкодженні ця організація порушується. Окремі нитки ДНК втрачають свою компактну структуру. Коли подається електричне поле, ДНК, яка має загальний негативний заряд, притягується до позитивно зарядженого анода. Неушкоджені ланцюги ДНК занадто великі і не виходять із порожнини, тоді як чим менші фрагменти, тим далі вони можуть вільно рухатися протягом певного періоду часу. Таким чином, кількість ДНК, яка залишає порожнину, є мірою кількости пошкоджень ДНК у клітині.
Аналіз зображення вимірює загальну інтенсивність флуоресценції всього нуклеоїду та флуоресценції мігрованої ДНК і порівнює ці два сигнали. Чим сильніший сигнал від перенесеної ДНК, тим більше пошкоджень. Загальна структура нагадує комету (звідси «аналіз комети») з круглою головою, що відповідає неушкодженій ДНК, яка залишається в порожнині, і хвостом пошкодженої ДНК. Чим яскравіший і довший хвіст, тим вищий рівень ушкодження.
Кометний аналіз є універсальною технікою для виявлення пошкоджень, і, з коригуванням протоколу, може використовуватися для кількісної оцінки присутности широкого спектру пошкоджень, що змінюють ДНК. Пошкодження, які зазвичай виявляються, — одноланцюгові розриви та подвійні розриви. Одноланцюгові і подвійні розриви виявляються як у лужних, так і в нейтральних умовах. У лужних умовах додаткові структури ДНК виявляються як пошкодження у місцях, де відбувається репарація ДНК.
Кометний аналіз є надзвичайно делікатним аналізом пошкодження ДНК, доводиться уникати всього, що може спричинити пошкодження або денатурацію ДНК, за винятком досліджуваного фактора. Найбільш поширеною формою аналізу є лужна версія. Завдяки простій і недорогій установці його можна використовувати в умовах, коли складніші аналізи недоступні
Примітки
- Singh, Narendra P.; McCoy, Michael T.; Tice, Raymond R.; Schneider, Edward L. (1 березня 1988). A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research (англ.). 175 (1): 184—191. doi:10.1016/0014-4827(88)90265-0. ISSN 0014-4827. PMID 3345800.
- Collins, A. R. (March 2004). The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3): 249—61. doi:10.1385/MB:26:3:249. PMID 15004294. S2CID 34355649.
- Nandhakumar, S; Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (Apr 2011). Evaluation of DNA damage using single-cell gel electrophoresis (Comet Assay). J Pharmacol Pharmacother. 2 (2): 107—11. doi:10.4103/0976-500X.81903. PMC 3127337. PMID 21772771. Архів оригіналу за 26 жовтня 2018. Процитовано 12 березня 2023.
{{}}
: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом () - Tice, R. R. (2000). Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines for in vitro and in vivo Genetic Toxicology Testing. Environmental and Molecular Mutagenesis. 35 (3): 206—21. doi:10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:3<206::AID-EM8>3.0.CO;2-J. PMID 10737956.
- Nandhakumar, S; Parasuraman, S; Shanmugam, M M; Rao, K R; Chand, P; Bhat, B V (2011). Evaluation of DNA damage using single-cell gel electrophoresis (Comet Assay). J Pharmacol Pharmacother. 2 (2): 107—11. doi:10.4103/0976-500X.81903. PMC 3127337. PMID 21772771.
{{}}
: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом () - Pu, Xinzhu; Wang, Zemin; Klaunig, James E. (6 серпня 2015). Alkaline Comet Assay for Assessing DNA Damage in Individual Cells. Current Protocols in Toxicology. 65: 3.12.1–11. doi:10.1002/0471140856.tx0312s65. ISBN . ISSN 1934-9262. PMID 26250399. S2CID 6105193.
- Møller, Peter (April 2006). The alkaline comet assay: towards validation in biomonitoring of DNA damaging exposures. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 98 (4): 336—345. doi:10.1111/j.1742-7843.2006.pto_167.x. ISSN 1742-7835. PMID 16623855.
Вікіпедія, Українська, Україна, книга, книги, бібліотека, стаття, читати, завантажити, безкоштовно, безкоштовно завантажити, mp3, відео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, малюнок, музика, пісня, фільм, книга, гра, ігри, мобільний, телефон, android, ios, apple, мобільний телефон, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Інтернет
Nemaye perevirenih versij ciyeyi storinki jmovirno yiyi she ne pereviryali na vidpovidnist pravilam proektu Kometnij analiz odnoklitinnij gel elektroforez tehnika gel elektroforezu yaka daye zmogu viyaviti poshkodzhennya DNK v okremih klitinah Metod buv rozroblenij u 1984 roci Ostlingom i Johansonom dlya viyavlennya dvolancyugovih rozriviv DNK 1 Z podalshoyu rozrobkoyu Singha v 1988 roci odnolancyugovi rozrivi DNK takozh mozhna viyaviti za dopomogoyu bazovih buferiv Princip kometnogo analizu polyagaye v tomu sho klitini vbudovani v agarozu lizuyut i piddayut diyi elektrichnogo polya vidomogo yak elektroforez Inkapsulyaciya klitin u suspenziyi agarozi vidbuvayetsya pri nizkij temperaturi lizis klitin u nejtralnih abo luzhnih pH gt 13 umovah Termin kometa vinik cherez migraciyu DNK pid chas gel elektroforezu yaka chasto nagaduye kometu 2 3 Pid chas elektroforezu negativno zaryadzhena DNK migruye do pozitivnogo polyusa i zavdyaki poram v agarozi fragmenti rozdilyayutsya vidpovidno do rozmiru oskilki menshi fragmenti dolayut bilshu vidstan nizh bilshi za pevnij chas Odnak hromosomna DNK zanadto velika shob migruvati yak cile v elektrichnomu poli Tilki poshkodzhena fragmentarna DNK zdatna migruvati z klitinnogo yadra V ultrafioletovomu mikroskopi vidno poshkodzheni klitini yaki poperedno buli obrobleni fluorescentnimi barvnikami takimi yak bromid etidiyu teper iz hvostom iz fragmentiv DNK sho nadaye yim viglyadu kometi Bud yaka klitina yaka maye yadro mozhe buti vikoristana v kometnomu analizi Vikonannya kometnogo analizu vidnosno proste ta shvidke Ocinyuyut kilkist poshkodzhenih i neposhkodzhenih klitinnih yader ruchnim sposobom abo za dopomogoyu specialnih komp yuternih program z vizualnim zapisom Znimok ekrana pid chas roboti programi CaspLab z analizu DNKProcedurared Inkapsulyaciya Zrazok klitin otrimanij z klitinnoyi kulturi in vitro abo doslidzhuvanogo in vivo zabarvlyuvannya zhivih klitin disperguyut na okremi klitini ta suspenzuyut u rozplavlenij agarozi z nizkoyu temperaturoyu plavlennya pri 37 C Cya monosuspenziya vidlivayetsya na predmetnomu skli mikroskopa Pokrivne shkelce trimayut pid kutom i nanosyat monosuspenziyu na cyatku kontaktu mizh pokrivnim i predmetnim steklami Koli pokrivne sklo opuskayetsya na predmetne rozplavlena agaroza roztikayetsya utvoryuyuchi tonkij shar Agaroza gelyuyetsya pri 4 C i pokrivne shkelce vidalyayetsya Agaroza utvoryuye matricyu vuglevodnih volokon yaki inkapsulyuyut klitini zakriplyuyuchi yih Agaroza vvazhayetsya osmotichno nejtralnoyu tomu rozchini mozhut pronikati v gel i diyati na klitini bez zmini polozhennya klitin U doslidzhenni in vitro klitini budut piddani diyi testovogo agenta ultrafioletovogo svitla ionizuyuchogo viprominyuvannya abo genotoksichnih himikativ dlya indukciyi poshkodzhennya DNK v inkapsulovanih klitinah Dlya kalibruvannya zazvichaj vikoristovuyetsya perekis vodnyu shob otrimati standartizovanij riven poshkodzhennya DNK 4 5 Lizis Potim predmetne sklo zanuryuyut u rozchin yakij viklikaye lizis klitin Lizisnij rozchin yakij chasto vikoristovuyut u kometnomu analizi skladayetsya z visokokoncentrovanogo vodnogo rozchinu soli chasto mozhna vikoristovuvati zvichajnu kuhonnu sil i miyuchogo zasobu napriklad Triton X 100 abo sarkozinat Riven pH rozchinu dlya lizisu mozhna regulyuvati zazvichaj mizh nejtralnim i luzhnim zalezhno vid tipu poshkodzhennya yake doslidzhuyetsya Vodnij rozchin soli porushuye bilki ta yih shemi zv yazuvannya vseredini klitini a takozh porushuye vmist RNK u klitini Miyuchij zasib rozchinyaye klitinni membrani Pid diyeyu rozchinu dlya lizisu klitini rujnuyutsya Usi bilki RNK membrani citoplazmatichni ta nukleoplazmatichni komponenti rujnuyutsya Zalishayetsya lishe DNK klitini yaka rozplutuyetsya shob zapovniti porozhninu v agarozi yaku zapovnyuvala vsya klitina Cya struktura nazivayetsya nukleoyidom zagalnij termin dlya strukturi v yakij zoseredzhena DNK Elektroforez Pislya lizisu klitin zazvichaj 1 2 godini pri 4 C predmetni stekla promivayut distilovanoyu vodoyu dlya vidalennya vsih solej i zanuryuyut u drugij rozchin rozchin dlya elektroforezu rN cogo rozchinu mozhna regulyuvati zalezhno vid tipu poshkodzhennya yake doslidzhuyetsya Shkelcya zalishayut na 20 hvilin u rozchini dlya elektroforezu pered zastosuvannyam elektrichnogo polya U luzhnih umovah podvijna spiral DNK denaturuyetsya nukleoyid staye odnolancyugovim Propuskayetsya elektrichne pole zazvichaj 1 volt sm protyagom 20 hvilin Potim shkelcya nejtralizuyut do rN 7 farbuyut specifichnoyu dlya DNK fluorescentnoyu farboyu ta analizuyut za dopomogoyu mikroskopa z priyednanim pristroyem iz zaryadovim zv yazkom cifrovoyu kameroyu yakij pid yednanij do komp yutera z programnim zabezpechennyam dlya analizu zobrazhen Struktura analizured Koncepciya yaka lezhit v osnovi kometnogo analizu polyagaye v tomu sho neposhkodzhena DNK zberigaye visokoorganizovanij zv yazok z matrichnimi bilkami v yadri Pri poshkodzhenni cya organizaciya porushuyetsya Okremi nitki DNK vtrachayut svoyu kompaktnu strukturu Koli podayetsya elektrichne pole DNK yaka maye zagalnij negativnij zaryad prityaguyetsya do pozitivno zaryadzhenogo anoda Neushkodzheni lancyugi DNK zanadto veliki i ne vihodyat iz porozhnini todi yak chim menshi fragmenti tim dali voni mozhut vilno ruhatisya protyagom pevnogo periodu chasu Takim chinom kilkist DNK yaka zalishaye porozhninu ye miroyu kilkosti poshkodzhen DNK u klitini Analiz zobrazhennya vimiryuye zagalnu intensivnist fluorescenciyi vsogo nukleoyidu ta fluorescenciyi migrovanoyi DNK i porivnyuye ci dva signali Chim silnishij signal vid perenesenoyi DNK tim bilshe poshkodzhen Zagalna struktura nagaduye kometu zvidsi analiz kometi z krugloyu golovoyu sho vidpovidaye neushkodzhenij DNK yaka zalishayetsya v porozhnini i hvostom poshkodzhenoyi DNK Chim yaskravishij i dovshij hvist tim vishij riven ushkodzhennya Kometnij analiz ye universalnoyu tehnikoyu dlya viyavlennya poshkodzhen i z koriguvannyam protokolu mozhe vikoristovuvatisya dlya kilkisnoyi ocinki prisutnosti shirokogo spektru poshkodzhen sho zminyuyut DNK Poshkodzhennya yaki zazvichaj viyavlyayutsya odnolancyugovi rozrivi ta podvijni rozrivi Odnolancyugovi i podvijni rozrivi viyavlyayutsya yak u luzhnih tak i v nejtralnih umovah U luzhnih umovah dodatkovi strukturi DNK viyavlyayutsya yak poshkodzhennya u miscyah de vidbuvayetsya reparaciya DNK Kometnij analiz ye nadzvichajno delikatnim analizom poshkodzhennya DNK dovoditsya unikati vsogo sho mozhe sprichiniti poshkodzhennya abo denaturaciyu DNK za vinyatkom doslidzhuvanogo faktora Najbilsh poshirenoyu formoyu analizu ye luzhna versiya Zavdyaki prostij i nedorogij ustanovci jogo mozhna vikoristovuvati v umovah koli skladnishi analizi nedostupni 6 7 Primitkired Singh Narendra P McCoy Michael T Tice Raymond R Schneider Edward L 1 bereznya 1988 A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells Experimental Cell Research angl 175 1 184 191 doi 10 1016 0014 4827 88 90265 0 ISSN 0014 4827 PMID 3345800 Collins A R March 2004 The comet assay for DNA damage and repair principles applications and limitations Mol Biotechnol 26 3 249 61 doi 10 1385 MB 26 3 249 PMID 15004294 S2CID 34355649 Nandhakumar S Parasuraman S Shanmugam MM Rao KR Chand P Bhat BV Apr 2011 Evaluation of DNA damage using single cell gel electrophoresis Comet Assay J Pharmacol Pharmacother 2 2 107 11 doi 10 4103 0976 500X 81903 PMC 3127337 PMID 21772771 Arhiv originalu za 26 zhovtnya 2018 Procitovano 12 bereznya 2023 a href wiki D0 A8 D0 B0 D0 B1 D0 BB D0 BE D0 BD Cite journal title Shablon Cite journal cite journal a Obslugovuvannya CS1 Storinki iz nepoznachenim DOI z bezkoshtovnim dostupom posilannya Tice R R 2000 Single Cell Gel Comet Assay Guidelines for in vitro and in vivo Genetic Toxicology Testing Environmental and Molecular Mutagenesis 35 3 206 21 doi 10 1002 SICI 1098 2280 2000 35 3 lt 206 AID EM8 gt 3 0 CO 2 J PMID 10737956 Nandhakumar S Parasuraman S Shanmugam M M Rao K R Chand P Bhat B V 2011 Evaluation of DNA damage using single cell gel electrophoresis Comet Assay J Pharmacol Pharmacother 2 2 107 11 doi 10 4103 0976 500X 81903 PMC 3127337 PMID 21772771 a href wiki D0 A8 D0 B0 D0 B1 D0 BB D0 BE D0 BD Cite journal title Shablon Cite journal cite journal a Obslugovuvannya CS1 Storinki iz nepoznachenim DOI z bezkoshtovnim dostupom posilannya Pu Xinzhu Wang Zemin Klaunig James E 6 serpnya 2015 Alkaline Comet Assay for Assessing DNA Damage in Individual Cells Current Protocols in Toxicology 65 3 12 1 11 doi 10 1002 0471140856 tx0312s65 ISBN 978 0471140856 ISSN 1934 9262 PMID 26250399 S2CID 6105193 Moller Peter April 2006 The alkaline comet assay towards validation in biomonitoring of DNA damaging exposures Basic amp Clinical Pharmacology amp Toxicology 98 4 336 345 doi 10 1111 j 1742 7843 2006 pto 167 x ISSN 1742 7835 PMID 16623855 Otrimano z https uk wikipedia org wiki Kometnij DNK analiz