Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
Гель-електрофорез — аналітичний метод хімії і молекулярної біології для розділення різних видів молекул. Суміш молекул пропускається через гель, який являє собою молекулярне сито, яке легше пропускає дрібніші молекули, аніж великі. Рушійну силу задає електричне поле, тому молекули мають бути заряджені.
Метод використовується в молекулярній біології для розділення фрагментів дезоксирибонуклеїнової, рибонуклеїнової кислоти або білків, використовуючи електричне поле, що створюється в гелевій матриці. Метод зазвичай застосовується для аналітичних цілей, але може також використовуватися як попередня стадія таких методів як мас-спектрометрія, поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ), полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), молекулярне клонування, секвенування ДНК, саузерн-блот, вестерн блот що застосовуються для аналізу послідовностей молекул або визначення певних білків.
Проведення
Досліджуваний препарат (суміш речовин, розчин білка, ДНК або РНК) вносять в лунку, розміщену в гелі — середовищі з сітчасто-просторовою структурою. Зазвичай для гель-електрофорезу використовують тонкі пластини гелю. Знаходячись в буферному розчині макромолекули володіють певним сумарним електричним зарядом, і коли через гель проходить електричний струм, вони переміщаються в електричному полі.
Молекули однакового розміру (однакового заряду) рухаються єдиним фронтом, створюючи в гелі дискретні невидимі смуги. Чим менший розмір молекул або більший їхній заряд, тим швидше вони рухаються. Поступово вихідний препарат, що складається з різних макромолекул, розділяється на зони, розподілені на довжині пластинки.
За ходом електрофорезу слідкують за переміщенням в гелі барвника — електрично зарядженої низькомолекулярної речовини, яку вносять в кожну лунку перед початком електрофорезу. Коли барвник досягає кінця пластини, електрофорез зупиняють. Якщо зразок являє собою дискретний набір макромолекул різного розміру, то після електрофорезу виходить набір чітких смуг, розміщених одна під одною. Якщо ж розміщення молекул за розміром більш-менш безперервне, то виходить розмита картина. За інтенсивністю забарвлення смуг можна судити про концентрацію макромолекул в зразку.
Визначення відносної молекулярної маси
Щоб визначити відносну молекулярну масу розділених фрагментів, одночасно проводять електрофорез маркерних макромолекул з відомими молекулярними масами. Набір маркерів повинен охоплювати весь діапазон молекулярних мас в даній системі. Зразок маркерних молекул вносять в окрему лунку, розміщену поблизу одного з країв пластинки. Логарифм відносної молекулярної маси маркера лінійно зв'язаний з його електрофоретичною рухливістю Rf — величиною, рівною відношенню відстаней, пройдених маркерною молекулою і барвником. Побудувавши графік залежності логарифма відносно молекулярних мас маркерів від Rf, можна знайти відносну молекулярну масу кожного компоненту зразку. Відносна молекулярна маса вимірюється в дальтонах, дволанцюгових нуклеїнових кислот — в кількості пар нуклеотидів, одноланцюгових — в кількості нуклеотидів.
Розділення нуклеїнових кислот
Для електрофорезного розділення нуклеїнових кислот середнього розміру зазвичай використовують агарозні гелі. Агароза — це чиста фракція, яку одержують з агару або безпосередньо з агароутворюючих морських водоростей. В 1% агарозному гелі можна розділити молекули розміром від 600 до 20 000 п.н. Для фракціонування більших молекул ДНК (мільйони пар основ), денатурованої ДНК і РНК використовують спеціальні системи електрофорезу. Деколи для вирішення спеціальних завдань для розділення ДНК використовують поліакриламідні гелі. В 20% поліакриламідному гелі можна розділити фрагменти ДНК, які складаються всього з шести основ і які відрізняються лише одним нуклеотидом.
На розділення нуклеїнових кислот в гель електрофорезі впливає не тільки молекулярна маса фрагментів ДНК або РНК, але й їх форма. Так, лінійні молекули рухаються швидше за такої ж маси кільцевих. Впливає на якість розділення і послідовність нуклеотидів, що може створювати додаткові вигини в молекулі нуклеїнової кислоти. На розділення ДНК також впливає зв'язування її з білком.
Одноланцюгові молекули ДНК і РНК розділяють в денатуруючих умовах: при нагріванні, з додаванням високих концентрацій сечовини або формальдегіду.
Детекцію смуг нуклеїнових кислот здійснюють за допомогою авторадіографії, в тому разі коли вони є міченими радіоактивними атомами (зазвичай, ізотопом фосфору з масою 32). В інших випадках до нуклеїнових кислот до чи після електрофорезу додають флуоресцентні мітки (бромистий етидій, [en] та інші), які зв'язуються з ДНК або РНК та виявляються за допомогою ультрафіолетового випромінювання на трансілюмінаторі.
Див. також
- Полімеразна ланцюгова реакція
- Бромистий етидій
- Трансілюмінатор
- Вестерн блот
- (Методи молекулярної біології)
- Нелінійний фрикціофорез
Примітки
- Berg JM, Tymoczko JL Stryer L (2002). Molecular Cell Biology (вид. 5th ed.). WH Freeman. ISBN .
- Masek, Tomas; Vopalensky, Vaclav; Suchomelova, Petra; Pospisek, Martin (2005). Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels. Analytical Biochemistry. 336 (1): 46—50. doi:10.1016/j.ab.2004.09.010. ISSN 0003-2697.
Джерела
- А. В. Сиволоб (2008). (PDF). К: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет». с. 335. Архів оригіналу (PDF) за 4 березня 2016. Процитовано 15 липня 2016.
 | Це незавершена стаття з молекулярної біології. Ви можете проєкту, виправивши або дописавши її. |
Вікіпедія, Українська, Україна, книга, книги, бібліотека, стаття, читати, завантажити, безкоштовно, безкоштовно завантажити, mp3, відео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, малюнок, музика, пісня, фільм, книга, гра, ігри, мобільний, телефон, android, ios, apple, мобільний телефон, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Інтернет
Gel elektroforez analitichnij metod himiyi i molekulyarnoyi biologiyi dlya rozdilennya riznih vidiv molekul Sumish molekul propuskayetsya cherez gel yakij yavlyaye soboyu molekulyarne sito yake legshe propuskaye dribnishi molekuli anizh veliki Rushijnu silu zadaye elektrichne pole tomu molekuli mayut buti zaryadzheni Ustanovka dlya elektroforezu bilkiv chi korotkih nukleyinovih kislot u poliakrilamidnomu geli vertikalnij elektroforez Aparat dlya provedennya gel elektroforezu nukleyinovih kislot gorizontalnij elektroforez Metod vikoristovuyetsya v molekulyarnij biologiyi dlya rozdilennya fragmentiv dezoksiribonukleyinovoyi ribonukleyinovoyi kisloti abo bilkiv vikoristovuyuchi elektrichne pole sho stvoryuyetsya v gelevij matrici Metod zazvichaj zastosovuyetsya dlya analitichnih cilej ale mozhe takozh vikoristovuvatisya yak poperednya stadiya takih metodiv yak mas spektrometriya polimorfizm dovzhini restrikcijnih fragmentiv PDRF polimerazna lancyugova reakciya PLR molekulyarne klonuvannya sekvenuvannya DNK sauzern blot vestern blot sho zastosovuyutsya dlya analizu poslidovnostej molekul abo viznachennya pevnih bilkiv ProvedennyaDoslidzhuvanij preparat sumish rechovin rozchin bilka DNK abo RNK vnosyat v lunku rozmishenu v geli seredovishi z sitchasto prostorovoyu strukturoyu Zazvichaj dlya gel elektroforezu vikoristovuyut tonki plastini gelyu Znahodyachis v bufernomu rozchini makromolekuli volodiyut pevnim sumarnim elektrichnim zaryadom i koli cherez gel prohodit elektrichnij strum voni peremishayutsya v elektrichnomu poli Molekuli odnakovogo rozmiru odnakovogo zaryadu ruhayutsya yedinim frontom stvoryuyuchi v geli diskretni nevidimi smugi Chim menshij rozmir molekul abo bilshij yihnij zaryad tim shvidshe voni ruhayutsya Postupovo vihidnij preparat sho skladayetsya z riznih makromolekul rozdilyayetsya na zoni rozpodileni na dovzhini plastinki Za hodom elektroforezu slidkuyut za peremishennyam v geli barvnika elektrichno zaryadzhenoyi nizkomolekulyarnoyi rechovini yaku vnosyat v kozhnu lunku pered pochatkom elektroforezu Koli barvnik dosyagaye kincya plastini elektroforez zupinyayut Yaksho zrazok yavlyaye soboyu diskretnij nabir makromolekul riznogo rozmiru to pislya elektroforezu vihodit nabir chitkih smug rozmishenih odna pid odnoyu Yaksho zh rozmishennya molekul za rozmirom bilsh mensh bezperervne to vihodit rozmita kartina Za intensivnistyu zabarvlennya smug mozhna suditi pro koncentraciyu makromolekul v zrazku Viznachennya vidnosnoyi molekulyarnoyi masiShob viznachiti vidnosnu molekulyarnu masu rozdilenih fragmentiv odnochasno provodyat elektroforez markernih makromolekul z vidomimi molekulyarnimi masami Nabir markeriv povinen ohoplyuvati ves diapazon molekulyarnih mas v danij sistemi Zrazok markernih molekul vnosyat v okremu lunku rozmishenu poblizu odnogo z krayiv plastinki Logarifm vidnosnoyi molekulyarnoyi masi markera linijno zv yazanij z jogo elektroforetichnoyu ruhlivistyu Rf velichinoyu rivnoyu vidnoshennyu vidstanej projdenih markernoyu molekuloyu i barvnikom Pobuduvavshi grafik zalezhnosti logarifma vidnosno molekulyarnih mas markeriv vid Rf mozhna znajti vidnosnu molekulyarnu masu kozhnogo komponentu zrazku Vidnosna molekulyarna masa vimiryuyetsya v daltonah dvolancyugovih nukleyinovih kislot v kilkosti par nukleotidiv odnolancyugovih v kilkosti nukleotidiv Rozdilennya nukleyinovih kislotDokladnishe Agaroznij gel z DNK pered elektroforezom Dlya elektroforeznogo rozdilennya nukleyinovih kislot serednogo rozmiru zazvichaj vikoristovuyut agarozni geli Agaroza ce chista frakciya yaku oderzhuyut z agaru abo bezposeredno z agaroutvoryuyuchih morskih vodorostej V 1 agaroznomu geli mozhna rozdiliti molekuli rozmirom vid 600 do 20 000 p n Dlya frakcionuvannya bilshih molekul DNK miljoni par osnov denaturovanoyi DNK i RNK vikoristovuyut specialni sistemi elektroforezu Dekoli dlya virishennya specialnih zavdan dlya rozdilennya DNK vikoristovuyut poliakrilamidni geli V 20 poliakrilamidnomu geli mozhna rozdiliti fragmenti DNK yaki skladayutsya vsogo z shesti osnov i yaki vidriznyayutsya lishe odnim nukleotidom Na rozdilennya nukleyinovih kislot v gel elektroforezi vplivaye ne tilki molekulyarna masa fragmentiv DNK abo RNK ale j yih forma Tak linijni molekuli ruhayutsya shvidshe za takoyi zh masi kilcevih Vplivaye na yakist rozdilennya i poslidovnist nukleotidiv sho mozhe stvoryuvati dodatkovi vigini v molekuli nukleyinovoyi kisloti Na rozdilennya DNK takozh vplivaye zv yazuvannya yiyi z bilkom Odnolancyugovi molekuli DNK i RNK rozdilyayut v denaturuyuchih umovah pri nagrivanni z dodavannyam visokih koncentracij sechovini abo formaldegidu Vizualizaciya smug DNK v agaroznomu geli Detekciyu smug nukleyinovih kislot zdijsnyuyut za dopomogoyu avtoradiografiyi v tomu razi koli voni ye michenimi radioaktivnimi atomami zazvichaj izotopom fosforu z masoyu 32 V inshih vipadkah do nukleyinovih kislot do chi pislya elektroforezu dodayut fluorescentni mitki bromistij etidij en ta inshi yaki zv yazuyutsya z DNK abo RNK ta viyavlyayutsya za dopomogoyu ultrafioletovogo viprominyuvannya na transilyuminatori Div takozhPolimerazna lancyugova reakciya Bromistij etidij Transilyuminator Vestern blot Metodi molekulyarnoyi biologiyi Nelinijnij frikcioforezPrimitkiBerg JM Tymoczko JL Stryer L 2002 Molecular Cell Biology vid 5th ed WH Freeman ISBN 0 7167 4955 6 Masek Tomas Vopalensky Vaclav Suchomelova Petra Pospisek Martin 2005 Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels Analytical Biochemistry 336 1 46 50 doi 10 1016 j ab 2004 09 010 ISSN 0003 2697 DzherelaA V Sivolob 2008 PDF K Vidavnicho poligrafichnij centr Kiyivskij universitet s 335 Arhiv originalu PDF za 4 bereznya 2016 Procitovano 15 lipnya 2016 Ce nezavershena stattya z molekulyarnoyi biologiyi Vi mozhete dopomogti proyektu vipravivshi abo dopisavshi yiyi