ЯМР спектроскопія білків

ЯМР-спектроскопі́я білкі́в (Ядерна магнітно-резонансна спектроскопія білків; англ. Nuclear magnetic resonance spectroscopy of proteins) — метод структурної біології, в якому ЯМР-спектроскопія використовується для отримання інформації про структуру і динаміку білків

Значення

Метод ЯМР спектроскопії був розвинутий для застосування з біолічними макромолекулами, серед інших, швейцарськими дослідниками Ріхардом Ернстом та Куртом Вуртріхом, які були відзначенні Нобелівською премію з хімії 1991 та 2002 року відповідно. ЯМР є універсальним і важливим інструментом у сучасній біомолекулярній науці, здатний давати інформацію про структуру, динаміку і взаємодії білків та нуклеінових кислот та їхніх лігандів. ЯМР-спектроскопія, поряд з рентгеноструктурним аналізом та кріоелектронною мікроскопією, зараз є єдиними методами, які можуть визначати структуру білків з атомною чіткістю. На відміну від рентгенівської кристалографії, ЯМР високого дозволу має можливість вивчати біомолекули в більш природному розчинному середовищі і не вимагає кристалізації. Визначення структури білків за допомогою ЯМР високої чіткості почалося з появою двовимірної спектроскопії на початку 1980-х. Перші двомірні техніки, які наразі об'єднують під назвою "підхід Вютріха", покладалися повністю на гомоядерні протонні 1Н ЯМР експерименти, (Wuthrich, 2003). Цей підхід є ефективним для дослідження білків вагою до ~ 12 кДа. З поширенням техніки ізотопного маркування рекомбінантних білків та гетероядерної спектроскопії на початку 1990-х розмір білків, придатних для структурних досліджень з високим дозволом, досяг близько 25 кДа і продовжує збільшуватись. Досягнення в гетероядерній спектроскопії були настільки успішними, що підхід Вютріха використовують все рідше, навіть для білків менше 12 кДа. В даний час отриманні структури білків вагою до ~ 25 кДа є рутинною процедурою. Основним лімітуючим фактором спектроскопії ЯМР є принципово властива їй низька чутливість та ускладнення спектру з ростом молекулярної маси біомолекули. Як наслідок, розмір білків, які можуть бути вивчені з атомним дозволом, є обмеженим. З розвитком спектрометрів з сильнішими магнітами, кращих зондів і нових спектроскопічних методів, стало можливим дослідження білків з масою до 80 кДа (Тугарінов та ін., 2005). ЯМР може також бути корисним і для більших білкових комплексів, особливо при поєднанні структурних даних низької чіткості з іншими методами, такими як рентгенівське розсіювання під малими кутами (Sunnerhagen та ін., 1996; Гришаєв та ін., 2005, 2008 ; Wang та ін., 2009). ЯМР також дозволяє досліджувати нестаціонарні процеси, такі як кінетика ферментів (Henzler-Уайлдман та ін, 2007.) та внутрішньомолекулярну динаміку (Ішима і Torchia, 2000; Palmer, 2004).

Динамічно розвивається зараз ^[en], який є дуже багатообіцяючою технікою для визначення структури біомолекул, особливо мембранних білків ( Andronesi та ін, 2005 ; Mc-Дермотт, 2009) та фібрілярних білкових агрегатів (Tycko, 2006).

Теоретичні основи методу

Докладніше: ЯМР-спектроскопія

Розщеплення енергетичних рівнів протону у магнітному полі

Головним чинником, який зумовлює можливість ЯМР-спектроскопії є наявність у атомних ядер спіну - квантовомеханічної характеристики елементарної частки, такої ж фундаментальної, як маса або заряд. Спін ядер може приймати цілі або напівцілі значення. Згідно з законами квантової механіки, ядра атомів з цілими спінами не мають магнітного моменту і у зовнішньому магнітному полі енергетичні рівні цих атомів є виродженими, тобто мають однакову енергію. На відміну від них, ядра з полуцілим спіном у магнітному полі демонструють зееманівське розщеплення. Для протону зі спіном 1/2 магнітний момент може приймати значення +1/2 та - 1/2, тоді для нього:

${\displaystyle \Delta {E_{Zeeman}}=E_{m_{l=-1/2}}-E_{m_{l=1/2}}={1 \over 2}\gamma \hbar B_{0}-\left(-{1 \over 2}\gamma \hbar B_{0}\right)=\gamma \hbar B_{0}\ }$

Ізотоп	${\displaystyle \gamma }$(10^7рад c^-1 T^-1)	Розповсюженість ізотопу(%)
^1H	26.752 212 8	99.99
^13C	6.728 284	1.07
^15N	−2.712 618 04	0.37
^31P	10.839	100
^19F	25.181	100

(А) Спад вільної індукції. Косинус-компонента гіпотетичного сигналу. (Б)Частотний спектр. Фурьє-перетворення поодинокого косинус сигналу дає єдиний пік на частоті процесії ядра. Швидкість спаду зумовлює ширину піку - повільний спад відповідає гострому піку

Наявність у системі декількох рівнів енергії є основою будь-якого спектроскопічного методу. Але на відміну від наприклад, оптичної спектроскопії, реєстрація енергії поглинання або випромінювання неможлива у разі ЯМР через наднизькі значення ${\displaystyle \Delta {E}}$. Замість цього, використовується підхід під назвою імпульсного перетворення Фур'є. Згідно з розподілом Максвелла — Больцмана у зовнішньому магнітному полі більшість ядер знаходяться на нижчому енергетичному стані, що приводить до об'ємної намагніченості зразку у напрямку прикладеного магнітного поля. Для маніпулювання з цією намагніченістю використовуються радіочастотні імпульси певної довжини та інтенсивності, які дозволяють змінити напрямок намагніченості ядер. Частіше за все використовують 90° або 180° імпульси. Після прикладення 90° імпульсу сумарний вектор намагніченості ядер не буде орієнтованим уздовж поля, а буде спрямований перпендикулярно до нього. Як тільки перпендикулярна намагніченість буде створена, система починає повертатися в стан з меншою енергією і вектор намагніченості повертається до початкової орієнтації здовж вектора зовнішнього поля, обертаючись навколо нього з певною частотою. Це обертання має назву прецесії. Прецесія вектора намагніченості через електромагнітну індукцію, викликає появу струмів у спеціальній котушці спектрометру, який реєструється, як залежний від часу сигнал і має назву спаду вільної індукції. Далі за допомогою математичної процедури, яка має назву швидкого перетворення Фур'є, сигнал перетворюється в функцію частоти, який і є питомим спектром. Частота такого сигналу має назву ларморової, залежіть від ${\displaystyle \Delta {E_{Zeeman}}}$ та за законом Планка дорівнює :

${\displaystyle \omega =\Delta {E_{Zeeman}}/\hbar =\gamma B_{0}\ }$, де ${\displaystyle \gamma }$ має назву гіроскопічного коефіцієнту, і є сталою для кожного ізотопу.

Хімічний зсув

Одномірний ¹H ЯМР спектр кальмодуліну (16.8 кДа) 95%/5% H₂O/D₂O розчин. Характерні діапазони для різних типів протонних ядер указані приблизно. Хімічний зсув приведений у стандартному вигляді - ppm, де 0ppm відповідає ларморової частоті протону

Якби магнітні властивості ядер не відчували впливу електронів молекули, то спектр будь-якої молекули являв би собою кілька окремих піків від ізотопів з напівцілим спіном, які входять до її складу. Насправді орбітальні електрони молекул створюють мікроскопічні магнітні поля, які посилюють чи послаблюють зовнішнє поле. Це призводить до різниці у значеннях поля для кожного атома у молекулі, і відповідно, до близьких, але різних значень ларморівської частоти для кожного атома у молекулі. Саме цей, так званий хімічний зсув дає спектральну інформацію про хімічну будову молекули. Різниця у частотах атомів з різним оточенням пропорційна силі зовнішнього поля, саме чому роздільна здатність спектрометру росте з ростом сили магнітного поля. Через те, що значення хімічного зсуву відносно ларморової частоти дуже малі, а також для уніфікації усіх ЯМР експериментів, ЯМР спектри відображають у мільйонних частинах (англ. parts per million, ppm) від значення Ларморової частоти. Спектрометри калібруються по резонансній частоті низькомолекулярних сполук ( або важкої води), що робить можливим порівняння спектрів, отриманих на різних спектрометрах.

Спін-спінова взаємодія (скалярна)

Кількість піків	Співвідношення інтенсивностей
Синглет	1
Дублет	1:1
Тріплет	1:2:1
Квартет	1:3:3:1
Квінтет	1:4:6:4:1
Секстет	1:5:10:10:5:1
Септет	1:6:15:20:15:6:1

Схематичний одномірний ¹H ЯМР спектр етанолу. Згідно зі спектром, у молекулі є три типи H атомів. Гідроген (H) -OH груп не взаємодіє з іншими, тому утворює синглетний пік, в той час як атоми гідрогену у складі CH₃- та CH₂-груп взаємодіють поміж собою, форумуючи триплет та кварет піків відповідно.

Ще одним важливим для ЯМР спектроскопії квантовим ефектом є взаємодія спінів ЯМР-активних атомів через хімічний зв'язок між ними. На практиці це приводить до розщеплення піків атомів. Для атомів зі спіном 1/2 взаємодія з n аналогічними атомами приводить до n+1 мультиплету з інтенсивністю піків яка підпорядковується трикутнику Паскаля. Важливо, що зв'язки між ядрами, які хімічно еквівалентні (тобто, мають однаковий хімічний зсув) не мають жодного впливу на спектри ЯМР, а розщеплення піків за рахунок взаємодії атомів, які знаходяться далі ніж за 3 хімічних зв'язки, практично не можливо спостерігати. Винятком є циклічні органічні сполуки, в яких картина розщеплення є складнішою.

Наприклад, у ¹H ЯМР спектрі етанолу, піки протонів зі складу групи CH₃ поділяються на триплет зі співвідношенням інтенсивностей 1:2:1 через взаємодію з протонами метиленової групи. Аналогічно, піки протонів з групи CH₂ розділяються на квартет зі співвідношенням інтенсивностей 1:3:3:1 через взаємодію з протонами CH₃. В принципі, два CH₂ протони мали б також бути розділені, ще й у дублет з утворенням подвійного квартету через взаємодію с протоном гідроксилу, але міжмолекулярний обмін кислих гідроксильних протонів часто унеможливлює спін-спінову взаємодію з цим атомом.

Спін-спінова взаємодія з будь-яким іншим атомом з напівцілим спіном також приводить до розщеплення піків, але їхня кількість і інтенсивність не підпорядковується правилу трикутника Паскаля через більші квантові числа цих ядер і, відповідно, більшу кількість можливих квантових станів. Спін-спінова взаємодія дає безпосередню інформацію про сусідні ЯМР-активні ядра в молекулі, що може бути особливо важливим для ідентифікації ядер з однаковим хімічним зсувом у складних багатоядерних спектрах. Однак в деяких випадках, розщеплення піків може бути непотрібним, тому спін-спінова взаємодія конкретного ізотопу може бути деактивована за допомогою спеціальних прийомів.

Релаксація

Докладніше: Релаксація

У ситуації рівноваги, коли до ЯМР активних ядер прикладено зовнішнє магнітне поле ${\displaystyle B_{0}}$, сумарний вектор намагніченості ${\displaystyle M_{0}}$ направлений вздовж поля, а перпендикулярні складові вектора намагніченості ${\displaystyle M_{0}=0}$ (якщо ось z направлена вздовж напрямку поля). У разі прикладання 90° імпульсу, вектор намагніченості потрапляє в площину XY, і починає обертатися з ларморовою частотою. Після закінчення дії імпульсу вектор намагніченості почне повертатися до початкового згідно з:

${\displaystyle M_{z}(t)=M_{0}\left(1-e^{-t/T_{1}}\right)}$

Параметр ${\displaystyle T_{1}}$ має назву спін-ґраткової релаксації. Існує інший тип релаксації у ЯМР, який зумовлений тим, що ядра прецесують не абсолютно синхронно, а як група багатьох так званих спінових пакетів. Це приводить до того що з часом сумарний вектор намагніченості від усіх ядер експоненційно зменшується, навіть якщо утримувати його у XY площині.

${\displaystyle M_{xy}(t)=M_{xy}(0)e^{-t/T_{2}}\,}$, де параметр T₂ - так звана спін-спінова релаксація.

У більшості практично важливих випадків ${\displaystyle T_{1}}$ більше ніж ${\displaystyle T_{2}}$, тому значення ${\displaystyle T_{1}}$ використовується як практичний ліміт, впродовж якого реєстрація ЯМР сигналу має сенс. Для більшості білків значення спін-ґраткової релаксації лежить у інтервалі десятків мс. Як вже було вказане вище, швидкість релаксації безпосередньо впливає на форму піків у ЯМР сигналі, а релаксаційні властивості макромолекул залежать від їхнього розміру, конформації, що робить можливим дослідження динаміки макромолекул за допомогою ЯМР.

Ядерний ефект Оверхаузера

Даний ефект полягає у зміні інтенсивності сигналу ЯМР при взаємодії двох ядер через диполь-дипольну взаємодію між ними. Ця взаємодія на відміну від, наприклад, скалярної спін-спінової взаємодії, відбувається без участі молекулярних електронів. Ядерна оверхаузівська взаємодія обернено пропорційна шостому степеню відстані, тому може бути зареєстрована тільки для атомів, які знаходяться в безпосередній близькості. Зміна інтенсивності піків у так званих NOESY експериментах (з англійської Nuclear Overhauser Effect) дає можливість вирахувати так званні дистанційні обмеження між ЯМР активними ядрами, тобто є основою для відтворення структури дослдіжуваної молекули.

Апаратна частина

Приготування зразку

Віднесення амінокислотних залишків

Рєстрейнс

Обчислювання та валідація структури

---

Визначення структури білків за допомогою ЯМР-спектроскопії зазвичай складається з кількох послідовних стадій, в кожній з яких використовуються свої методи. Стисло, ці стадії включають підготовку зразка, отримання спектру, розпізнавання резонансів, обчислення зв'язків і в результаті обчислення та оцінки структури.

Див. також

• ЯМР-спектроскопія

Джерела

1. McDermott, A. 2009. Structure and dynamics of membrane proteins by magic angle spinning solid-state NMR. Ann. Rev. Biophys. 38:385-403.
2. Tugarinov, V. Choy, W., Orekhov, V. Solution NMR-derived global fold of a monomeric 82-kDa enzyme / Kay, L.E // Proc Natl Acad Sci U S A. — 2005. — Т. 102(3). — С. 622-7.