Норсвестерн-блот — це експериментальна техніка в молекулярній біології, що певною мірою є комбінацією вестерн-блоту та нозерн-блоту; в результаті норсвестерн-блот експерименту можливо виявити взаємодії між РНК та білками. Споріднена техніка, вестерн-блот, використовується для виявлення окремих білків у складних сумішах за допомогою розділення гель-електрофорезом, переносом продуктів розділення на нітроцелюлозну мембрану та обробку мембрани специфічним антитілом з барвником для детекції. Інша споріднена техніка, нозерн-блот, використовується для виявлення РНК; при цьому комплементарні гибридизаційні олігонуклеотиди-зонди використовуються замість антитіл для обробки мембрани з продуктами електрофоретичного розділення. Норсвестерн-блот поєднує в собі елементи вестрен-блоту та нозерн-блоту, що дозволяє специфічно виявляти РНК-білкові взаємодії.
Історія
Едвіном Саузерном було створено експериментальну методику, що дістала назву саузерн-блот, яка дозволяла детекцію молекул ДНК у сумішах. Після розділення молекул ДНК у суміші за допомогою гель-електрофорезу, продукти розділення переносились на спеціальну мембрану; після цього мембрана оброблялась ізотопно-міченим олігонуклеотид-зондом комплементарним до послідовності, яку потрібно детектувати. Поява радіоактивних ділянок на мембрані сигналізує про наявність в ній цільової послідовності ДНК. Дуже швидко ця методика була адаптована для детекції інших біомолекул. Результатом стало виникнення вестерн-блоту (детекція білків), нозерн-блоту (детекція РНК), саузернвестерн-блоту (детекція ДНК-білкових взаємодій), істерн-блоту (детекція посттрансляційних модифікацій в білках) та власне норсвестерн-блоту (детекція РНК-білкових взаємодій).
Особливості техніки
Першим етапом норсвестерн-блоту є розділення РНК-зв'язуючих білків за допомогою електрофорезу. Після цього розділені відповідно до заряду та молекулярної маси білки переносяться на нітроцелюлозну мембрану.
Далі, мембрана обробляються протеїн-вмісним блокуючим розчином, щоб уникнути неспецифічного зв'язування антитіл з мембраною. Після блокування, розчин певної конкурентної міченої РНК додається до мембрани та інкубується, що призводить до зв'язування РНК із відповідними РНК-зв'язуючими білками, якщо вони присутні на мембрані. Час інкубації залежить від концентрацій РНК та білку та константи дисоціації комплексу; типовий час інкубації складає приблизно одну годину. Після цього надлишок РНК відмивається (фосфатний буфер) а потім радіоактивна РНК, що зв'язалась з РНК-зв'язуючими білками, детектується за допомогою ауторадіографії.
Практичне застосування
Цей метод дає змогу швидко визначити наявність, молекулярну масу та відносну кількість РНК-зв'язуючих білків. Цей метод може бути поєднаний з вестерн-блотом, щоб отримати додаткову інформацію щодо ідентичності окремих білків.
Переваги та недоліки
Перевагою норсвестерн-блоту є можливість відносно швидко визначити кількість білків, які зв'язуються з певною послідовністю РНК. Він як правило є першим кроком в аналізі РНК-білкових взаємодій та дає первинну інформацію, яка необхідна для подальшого вивчення конкретних білків.
Недоліком методу є те, що певні РНК-білкові комплекси з малою константою асоціації не можуть бути ідентифіковані. Використання неоптимальних умов провдення окремих стадій призводить до низького відношення сигнал/шум, що також ускладнює інтерпретацію результатів. Окрім цього, необоротна денатурація білків також може призводити до неможливості ідентифікації їх РНК-зв'язуючих властивостей. Неможливим також є вивчення РНК-білкових комплексів, що включають декілька білкових субодиниць.
Див. також
Посилання
- (5 листопада 1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. . Т. 98, № 3. с. 503—517. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397.
- Nelson, Cox (2013). Lehninger Principles of Biochemistry. New York, NY: W.H. Freeman and Company. с. 179. ISBN .
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008.
- Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol.
- Rapley, R (2000). The Nucleic Acid Protocols Handbook. Totowa, NJ: Humana Press Inc. с. 783. ISBN .
- Nicholas; Nelson (2013). . Journal of Investigative Dermatology. Т. 133, № e10. с. e10. doi:10.1038/jid.2013.216. Архів оригіналу за 20 січня 2016. Процитовано 28 березня 2016.
- Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). Identification of proteins binding specifically to the 3'-untranslated region of granulocyte/macrophage-colony stimulating factro mRNA (PDF). Nucleic Acids Research. Т. 25, № 12. с. 2417—2423. doi:10.1093/nar/25.12.2417. PMID 9171094. Процитовано 7 травня 2014.
- Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (21 липня 1998). . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Т. 95, № 15. с. 8514. Bibcode:1998PNAS...95.8514L. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. PMID 9671709. Архів оригіналу за 24 вересня 2015. Процитовано 23 квітня 2014.
- C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). Use of non-radioactive detection method for north- and southwestern blot. Methods of Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. Т. 536. с. 441—9. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_44. ISBN . PMID 19378081.
- Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (May 1995). (PDF). The Journal of Cell Biology. Т. 129, № 4. с. 1023—1032. doi:10.1083/jcb.129.4.1023. PMC 2120489. PMID 7744952. Архів оригіналу (PDF) за 13 вересня 2019. Процитовано 7 травня 2014.
- Stohlman, S A; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J Deans (1988). . Journal of Virology. 11. Т. 62, № 11. с. 4288. Архів оригіналу за 13 вересня 2019. Процитовано 25 березня 2014.
- Thangasamy, Saminathan. . Архів оригіналу за 26 березня 2014. Процитовано 26 березня 2014.
- Smith, Christopher W.J. (1998). RNA-Protein Interactions : A Practical Approach: A Practical Approach. Oxford University Press. с. 187. ISBN .
- Nicholson, Allen W. (2001). Ribonucleases, Part A: Functional Roles and Mechanisms of Action: Functional Roles and Mechanisms of Action. Academic Press. с. 409. ISBN .
Вікіпедія, Українська, Україна, книга, книги, бібліотека, стаття, читати, завантажити, безкоштовно, безкоштовно завантажити, mp3, відео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, малюнок, музика, пісня, фільм, книга, гра, ігри, мобільний, телефон, android, ios, apple, мобільний телефон, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Інтернет
Norsvestern blot ce eksperimentalna tehnika v molekulyarnij biologiyi sho pevnoyu miroyu ye kombinaciyeyu vestern blotu ta nozern blotu v rezultati norsvestern blot eksperimentu mozhlivo viyaviti vzayemodiyi mizh RNK ta bilkami Sporidnena tehnika vestern blot vikoristovuyetsya dlya viyavlennya okremih bilkiv u skladnih sumishah za dopomogoyu rozdilennya gel elektroforezom perenosom produktiv rozdilennya na nitrocelyuloznu membranu ta obrobku membrani specifichnim antitilom z barvnikom dlya detekciyi Insha sporidnena tehnika nozern blot vikoristovuyetsya dlya viyavlennya RNK pri comu komplementarni gibridizacijni oligonukleotidi zondi vikoristovuyutsya zamist antitil dlya obrobki membrani z produktami elektroforetichnogo rozdilennya Norsvestern blot poyednuye v sobi elementi vestren blotu ta nozern blotu sho dozvolyaye specifichno viyavlyati RNK bilkovi vzayemodiyi Tipovi rezultati IstoriyaSer Edvin Sauzern 2012 rik Edvinom Sauzernom bulo stvoreno eksperimentalnu metodiku sho distala nazvu sauzern blot yaka dozvolyala detekciyu molekul DNK u sumishah Pislya rozdilennya molekul DNK u sumishi za dopomogoyu gel elektroforezu produkti rozdilennya perenosilis na specialnu membranu pislya cogo membrana obroblyalas izotopno michenim oligonukleotid zondom komplementarnim do poslidovnosti yaku potribno detektuvati Poyava radioaktivnih dilyanok na membrani signalizuye pro nayavnist v nij cilovoyi poslidovnosti DNK Duzhe shvidko cya metodika bula adaptovana dlya detekciyi inshih biomolekul Rezultatom stalo viniknennya vestern blotu detekciya bilkiv nozern blotu detekciya RNK sauzernvestern blotu detekciya DNK bilkovih vzayemodij istern blotu detekciya posttranslyacijnih modifikacij v bilkah ta vlasne norsvestern blotu detekciya RNK bilkovih vzayemodij Osoblivosti tehnikiPershim etapom norsvestern blotu ye rozdilennya RNK zv yazuyuchih bilkiv za dopomogoyu elektroforezu Pislya cogo rozdileni vidpovidno do zaryadu ta molekulyarnoyi masi bilki perenosyatsya na nitrocelyuloznu membranu Dali membrana obroblyayutsya proteyin vmisnim blokuyuchim rozchinom shob uniknuti nespecifichnogo zv yazuvannya antitil z membranoyu Pislya blokuvannya rozchin pevnoyi konkurentnoyi michenoyi RNK dodayetsya do membrani ta inkubuyetsya sho prizvodit do zv yazuvannya RNK iz vidpovidnimi RNK zv yazuyuchimi bilkami yaksho voni prisutni na membrani Chas inkubaciyi zalezhit vid koncentracij RNK ta bilku ta konstanti disociaciyi kompleksu tipovij chas inkubaciyi skladaye priblizno odnu godinu Pislya cogo nadlishok RNK vidmivayetsya fosfatnij bufer a potim radioaktivna RNK sho zv yazalas z RNK zv yazuyuchimi bilkami detektuyetsya za dopomogoyu autoradiografiyi Praktichne zastosuvannyaCej metod daye zmogu shvidko viznachiti nayavnist molekulyarnu masu ta vidnosnu kilkist RNK zv yazuyuchih bilkiv Cej metod mozhe buti poyednanij z vestern blotom shob otrimati dodatkovu informaciyu shodo identichnosti okremih bilkiv Perevagi ta nedolikiPerevagoyu norsvestern blotu ye mozhlivist vidnosno shvidko viznachiti kilkist bilkiv yaki zv yazuyutsya z pevnoyu poslidovnistyu RNK Vin yak pravilo ye pershim krokom v analizi RNK bilkovih vzayemodij ta daye pervinnu informaciyu yaka neobhidna dlya podalshogo vivchennya konkretnih bilkiv Nedolikom metodu ye te sho pevni RNK bilkovi kompleksi z maloyu konstantoyu asociaciyi ne mozhut buti identifikovani Vikoristannya neoptimalnih umov provdennya okremih stadij prizvodit do nizkogo vidnoshennya signal shum sho takozh uskladnyuye interpretaciyu rezultativ Okrim cogo neoborotna denaturaciya bilkiv takozh mozhe prizvoditi do nemozhlivosti identifikaciyi yih RNK zv yazuyuchih vlastivostej Nemozhlivim takozh ye vivchennya RNK bilkovih kompleksiv sho vklyuchayut dekilka bilkovih subodinic Div takozhSauzern blot Vestern blot Nozern blot Gel elektroforezPosilannya 5 listopada 1975 Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis T 98 3 s 503 517 doi 10 1016 S0022 2836 75 80083 0 ISSN 0022 2836 PMID 1195397 Nelson Cox 2013 Lehninger Principles of Biochemistry New York NY W H Freeman and Company s 179 ISBN 978 1 4641 0962 1 Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P 2008 Kevil C G Walsh L Laroux F S Kalogeris T Grisham M B Alexander J S 1997 An Improved Rapid Northern Protocol Rapley R 2000 The Nucleic Acid Protocols Handbook Totowa NJ Humana Press Inc s 783 ISBN 0 89603 459 3 Nicholas Nelson 2013 Journal of Investigative Dermatology T 133 e10 s e10 doi 10 1038 jid 2013 216 Arhiv originalu za 20 sichnya 2016 Procitovano 28 bereznya 2016 Verena Bichsel Alfred Walz Matthias Bickel 1997 Identification of proteins binding specifically to the 3 untranslated region of granulocyte macrophage colony stimulating factro mRNA PDF Nucleic Acids Research T 25 12 s 2417 2423 doi 10 1093 nar 25 12 2417 PMID 9171094 Procitovano 7 travnya 2014 Liao Huey Jane Ryuji Kobyashi and Michael B Matthews Mathews M B 21 lipnya 1998 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America T 95 15 s 8514 Bibcode 1998PNAS 95 8514L doi 10 1073 pnas 95 15 8514 PMID 9671709 Arhiv originalu za 24 veresnya 2015 Procitovano 23 kvitnya 2014 C Franke Grafe D Bartsch H Bachmann M 2009 Use of non radioactive detection method for north and southwestern blot Methods of Molecular Biology Methods in Molecular Biology T 536 s 441 9 doi 10 1007 978 1 59745 542 8 44 ISBN 978 1 934115 73 2 PMID 19378081 Schumacher Jill Keesook Lee Susanne Edelhoff Robert Braun May 1995 PDF The Journal of Cell Biology T 129 4 s 1023 1032 doi 10 1083 jcb 129 4 1023 PMC 2120489 PMID 7744952 Arhiv originalu PDF za 13 veresnya 2019 Procitovano 7 travnya 2014 Stohlman S A R S Baric G N Nelson L H Soe L M Welter R J Deans 1988 Journal of Virology 11 T 62 11 s 4288 Arhiv originalu za 13 veresnya 2019 Procitovano 25 bereznya 2014 Thangasamy Saminathan Arhiv originalu za 26 bereznya 2014 Procitovano 26 bereznya 2014 Smith Christopher W J 1998 RNA Protein Interactions A Practical Approach A Practical Approach Oxford University Press s 187 ISBN 9780191591624 Nicholson Allen W 2001 Ribonucleases Part A Functional Roles and Mechanisms of Action Functional Roles and Mechanisms of Action Academic Press s 409 ISBN 9780080496917