Піросеквенування англ Pyrosequencing швед Pyrosekvensering метод визначення послідовності нуклеотидів ДНК що ґрунтується

Піросеквенування (англ. Pyrosequencing, швед. Pyrosekvensering) — метод визначення послідовності нуклеотидів ДНК, що ґрунтується на принципі «синтез через інкорпорацію», на відміну від секвенування Сенгера (англ. Sanger sequencing), де використовується капілярний електрофорез. Цю технологію створили дослідники (швед. Pål Nyrén) та його PhD-студент (англ. Mostafa Ronaghi) у Королівському Технічному Інституті (швед. Kungliga Tekniska Högskolan, KTH) у Стокгольмі, у 1996 р.

Піросеквенсер Pyromark Q24 з робочою станцією

Галузі застосування

Епігенетика
- Метилювання ДНК
Ветеринарія
- Визначення патогенної інфекції
Генетика
- Визначення зиготності поліплоїдних організмів
- Визначення поліморфізму окремо взятого нуклеотиду (англ. single nucleotide polymorphism)
Фармакогенетика
Судова медицина

Технологія

Крок 1

Ампліфікація сегменту ДНК за допомогою ПЛР, при цьому один з праймерів — . Після денатурації, біотинильований одноланцюговий ПЛР-амплікон ізолюється та гібридизується з sequencing-праймером.

Крок 2

Гібридизований праймер та одноланцюговий ПЛР-амплікон інкубуються з наступними ензимами: ДНК-полімераза, , , , а також з субстратами аденозин-5'-фосфосульфатом (АФС) та .

Крок 3

До реакції додається один з -три-фосфат (дНТФ) — , , чи . ДНК-полімераза каталізує додавання певного дНТФ до sequencing-праймера. Коли є комплементарність до нуклеотида в ланцюгу ПЛР-амплікона, відбувається інкорпорація. Кожна вдала інкорпорація супроводжується вивільненням пірофосфату (ПФі), в кількості, що еквімолярна кількості інкорпорованих нуклеотидів.

Крок 4

Типовий приклад Пірограми, в якій демонструється послідовність нуклеотидів певного фрагменту ДНК

конвертує ПФі в АТФ в присутності АФС. Цей АТФ реагує з люциферином, внаслідок чого люциферин конвертується в оксилюциферин, що супроводжується генерацією видимого світла, кількість якого пропорційна кількості АТФ. Це світло, що продукується внаслідок люциферин-каталізуючої реакції фіксується спеціальними CCD-сенсорами, які передають сигнал до комп'ютера, програмне забезпечення якого конвертує сигнали та виводить дані у вигляді піків, з яких формується пірограма (англ. Pyrogram). Висота кожного піка пропорційна кількості інкорпорованих нуклеотидів.

Крок 5

Завдяки апіразі відбувається деградація неінкорпорованих нуклеотидів та АТФ. Коли деградація завершується, додається інший нуклеотид.

Крок 6

Додавання дНТП відбувається послідовно. Слід зазначити, що деоксиаденозин алфа-тіо трифосфат використовується для заміни природного деоксиаденозин-трифосфату дАТФ, який використовується ДНК-полімеразою, але не взаємодіє з люциферазою. Коли процес продовжується, комплементарний ланцюг ДНК елонгується та формує послідовність нуклеотидів та у вигляді сигналів (піків) відображається як пірограма.

Посилання

Сторінка власника технології^{[недоступне посилання з вересня 2019]}

Примітки

Ronaghi та ін. (2000). Improved performance of Pyrosequencing using single-stranded DNA-binding protein. Analytical Biochemistry. 286: 282-288. doi:10.1006/abio.2000.4808". PMID 11067751. {{}}: Вказано більш, ніж один |pages= та |page= (); Явне використання «та ін.» у: |author= ()

Див. також

[1] Ronaghi та ін. (2000). Improved performance of Pyrosequencing using single-stranded DNA-binding protein. Analytical Biochemistry. 286: 282-288. doi:10.1006/abio.2000.4808". PMID 11067751. {{}}: Вказано більш, ніж один |pages= та |page= (); Явне використання «та ін.» у: |author= ()