Azərbaycanca
Беларускі
Dansk
Deutsch
Española
Français
Indonesia
Italiana
日本語
Қазақ
Lietuvos
Nederlands
Português
Русский
සිංහල
แบบไทย
Türkçe
Українська
中國人
United State
Afrikaans
Полігістидиновий тег — амінокислотний мотив у білках, складається як мінімум із шести розташованих поруч залишків гістидину (His). Інші назви — гексагістидин-тег, 6xHis-тег, His6 тег, а також комерційна назва His-tag (зареєстрована EMD Biosciences). Полігістидиновий тег вводиться у білки методами генної інженерії; він може бути розташований на N- або C-кінці поліпептиду.
В молекулярній біології та біотехнології полігістидиновий тег використовують як мітку для афінної очистки рекомбінантних білків із середовища в якому вони експресуються. Він також дозволяє детектувати білки в живих клітинах за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Історія та правовий статус
Цей амінокислотний мотив був винайдений фармакологічною та біотехнологічною компанією Roche. На основі цього тегу були розроблені комерційно-доступні засоби для швидкого виділення та очищення рекомбінантних білків; комерційні «кіти» поставляються такими компаніями як Qiagen, Sigma, Thermo Scientific, GE Healthcare, Macherey-Nagel, Clontech, Bio-Rad, та іншими. Використання тегу в академічних та некомерційних дослідженнях необмежене; в той же час, компанії, що використовують цю технологію, при виробництві комерційних продуктів мають сплачувати роялті Roche. Термін дії оригінального патенту закінчився 11 лютого 2003, і тому наразі є суспільним надбанням; сплата роялті обґрунтовується новими та більш вузькими патентами. Відповідні амінокислотні послідовності доступні для комерційного використання; наприклад, оптимізований поліпептид MK(HQ)6 може бути використаний для інтенсивної експресії в E. coli з можливістю видалення тегу з протеїну після очистки. Загальне число залишків гістидину може варіюватися. Тег може бути поєднаний із відповідними лінкерними амінокислотними послідовностями які спрощують видалення тегу з цільового білка за допомогою ендопептидаз. Використання додаткових послідовностей можна уникнути якщо полігістидиновий тег розташований на N-кінці полігістидину; в цьому разі тег може бути видалений безпосередньо за допомогою екзопептидаз.
Застосування
Виділення та очистка білків
Полігістидиновий тег дуже часто використовується для мічення та наступної очистки рекомбінантних білків, що експресуються в Escherichia coli та в інших прокаріотичних системах експресії. Бактеріальні клітини, що містять білок, збираються за допомогою центрифугування та внутрішньоклітинні білки (в тому числі цільовий білок мічений тегом) переводяться в розчин після лізису (руйнації) бактеріальних клітин. Отриманий розчин багатьох білків інкубується (настоюється) у присутності полімерного носія, що містить двовалентні іони нікелю або кобальту. Полімерним носієм найчастіше є сефароза або агароза модифікована специфічними хелаторами, такими як імінодиоцтова кислота (Ni-IDA) та нітрилотриоцтова кислота (Ni-NTA) для нікелю та карбоксіметиласпартат (Co-CMA) для кобальту. Полігістидиновий тег зв'язується з цими хелаторами з мікромолярною афінністю, тоді як білки, що не містять тегу, залишаються в розчині й можуть бути відділенні промиванням колонки фосфатним буфером. Після цього рекомбінантний білок може бути «знятий» з полімерного носія за допомогою буферу, що містить 150—300 мМ імідазолу. Кількість та якість отриманого білка може бути визначена за допомогою SDS-PAGE та Вестерн-блоту.
Афінна очистка білків за допомогою полігістидинового тегу дає відносно чисті білки після експресії в прокаріотичних клітинах. Залежно від області застосування, очистка білків після експресії в еукаріотах можлива з використанням тандемної афінної очистки, коли два теги використовуються для отримання білка більш високої чистоти.
Полігістидиновий тег є гарним методом очистки білків за денатуруючих умов, тому що з'вязування білка з хелатором на полімері не залежить від присутності денатуруючих агентів у середовищі.
Введення тегу
Найбільш поширеною версією полігістидинового тегу є така, що містить шість послідовних залишків гістидину (6xHis тег), які додаються до білку на N-кінець перед залишком метіоніну або на C-кінець одразу перед стоп-кодоном. Вибір способу мічення (N/C-кінець) залежить головним чином від властивостей білку та метода видалення тегу після експресії. Мічення по окремому кінцю неможливе, якщо він глибоко занурений в протеїнову глобулу, або якщо він виконує певну функцію. Більшість екзопептидаз можуть видалити полігістидиновий тег тільки якщо він розташований на N-кінці.
Є два загальні методи введення тегу в поліпептидну структуру білку. Найбільш простим методом є вставка гену що кодує білок в плазміду або інший вектор що вже містить послідовність кодуючу His-tag; таким чином, після вставки гену в вектор тег одразу попаде в протеїн-кодуючу рамку зчитування і бути приєднаний до протеїну під час експресії. Іншим загальним методом є ампліфікація гену що кодує цільовий білок за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у присутності спеціально створених праймерів; один з пари праймерів має містити декілька раз повторений гістидиновий кодон (CAT або CAC) впритул до старт- або стоп-кодонів, на додачу до власне послідовності праймера комплементарної до кінцевих нуклеотидних основ гену.
Приклад праймерів створених для введення гексагістидинового тегу за допомогою ПЛР. Вісімнадцять нуклеотидів, що кодують шість гістидинів, вставлені безпосередньо після СТАРТ-кодону або безпосередньо перед СТОП-кодоном. Як мінімум 16 нуклеотидів праймеру мають бути комплементарними до термінальних фрагментів гену, що кодує потрібний білок. Завдяки вставці шести гістидинів білок стає важчим приблизно на 1 кДа. Зазвичай, на додачу до гексагістидинового тегу, мінімальний лінкер, такий як gly-gly-gly або gly-ser-gly, вставляється між ним та протеїном; це мінімізує вплив тегу на властивості цільового білку.
Детекція
Полігістидиновий тег може бути використаний для ідентифікації міченого білку (вестерн-блот, флуоресцентна мікроскопія, тощо) за допомогою His6-специфічних антитіл.
Посилання
- Hochuli, E.; Bannwarth, W.; Döbeli, H.; Gentz, R.; Stüber, D. (1988). Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. Т. 6, № 11. с. 1321—1325. doi:10.1038/nbt1188-1321.
- Hengen, P (1995). Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli. Trends in Biochemical Sciences. Т. 20, № 7. с. 285—6. doi:10.1016/S0968-0004(00)89045-3. PMID 7667882.
- Gavin, AC; Bösche, M; Krause, R; Grandi, P; Marzioch, M; Bauer, A; Schultz, J; Rick, JM та ін. (2002). Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. Т. 415, № 6868. с. 141—7. doi:10.1038/415141a. PMID 11805826.
Вікіпедія, Українська, Україна, книга, книги, бібліотека, стаття, читати, завантажити, безкоштовно, безкоштовно завантажити, mp3, відео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, малюнок, музика, пісня, фільм, книга, гра, ігри, мобільний, телефон, android, ios, apple, мобільний телефон, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Інтернет
Poligistidinovij teg aminokislotnij motiv u bilkah skladayetsya yak minimum iz shesti roztashovanih poruch zalishkiv gistidinu His Inshi nazvi geksagistidin teg 6xHis teg His6 teg a takozh komercijna nazva His tag zareyestrovana EMD Biosciences Poligistidinovij teg vvoditsya u bilki metodami gennoyi inzheneriyi vin mozhe buti roztashovanij na N abo C kinci polipeptidu V molekulyarnij biologiyi ta biotehnologiyi poligistidinovij teg vikoristovuyut yak mitku dlya afinnoyi ochistki rekombinantnih bilkiv iz seredovisha v yakomu voni ekspresuyutsya Vin takozh dozvolyaye detektuvati bilki v zhivih klitinah za dopomogoyu fluorescentnoyi mikroskopiyi Istoriya ta pravovij statusCej aminokislotnij motiv buv vinajdenij farmakologichnoyu ta biotehnologichnoyu kompaniyeyu Roche Na osnovi cogo tegu buli rozrobleni komercijno dostupni zasobi dlya shvidkogo vidilennya ta ochishennya rekombinantnih bilkiv komercijni kiti postavlyayutsya takimi kompaniyami yak Qiagen Sigma Thermo Scientific GE Healthcare Macherey Nagel Clontech Bio Rad ta inshimi Vikoristannya tegu v akademichnih ta nekomercijnih doslidzhennyah neobmezhene v toj zhe chas kompaniyi sho vikoristovuyut cyu tehnologiyu pri virobnictvi komercijnih produktiv mayut splachuvati royalti Roche Termin diyi originalnogo patentu zakinchivsya 11 lyutogo 2003 i tomu narazi ye suspilnim nadbannyam splata royalti obgruntovuyetsya novimi ta bilsh vuzkimi patentami Vidpovidni aminokislotni poslidovnosti dostupni dlya komercijnogo vikoristannya napriklad optimizovanij polipeptid MK HQ 6 mozhe buti vikoristanij dlya intensivnoyi ekspresiyi v E coli z mozhlivistyu vidalennya tegu z proteyinu pislya ochistki Zagalne chislo zalishkiv gistidinu mozhe variyuvatisya Teg mozhe buti poyednanij iz vidpovidnimi linkernimi aminokislotnimi poslidovnostyami yaki sproshuyut vidalennya tegu z cilovogo bilka za dopomogoyu endopeptidaz Vikoristannya dodatkovih poslidovnostej mozhna uniknuti yaksho poligistidinovij teg roztashovanij na N kinci poligistidinu v comu razi teg mozhe buti vidalenij bezposeredno za dopomogoyu ekzopeptidaz ZastosuvannyaVidilennya ta ochistka bilkiv Poligistidinovij teg duzhe chasto vikoristovuyetsya dlya michennya ta nastupnoyi ochistki rekombinantnih bilkiv sho ekspresuyutsya v Escherichia coli ta v inshih prokariotichnih sistemah ekspresiyi Bakterialni klitini sho mistyat bilok zbirayutsya za dopomogoyu centrifuguvannya ta vnutrishnoklitinni bilki v tomu chisli cilovij bilok michenij tegom perevodyatsya v rozchin pislya lizisu rujnaciyi bakterialnih klitin Otrimanij rozchin bagatoh bilkiv inkubuyetsya nastoyuyetsya u prisutnosti polimernogo nosiya sho mistit dvovalentni ioni nikelyu abo kobaltu Polimernim nosiyem najchastishe ye sefaroza abo agaroza modifikovana specifichnimi helatorami takimi yak iminodioctova kislota Ni IDA ta nitrilotrioctova kislota Ni NTA dlya nikelyu ta karboksimetilaspartat Co CMA dlya kobaltu Poligistidinovij teg zv yazuyetsya z cimi helatorami z mikromolyarnoyu afinnistyu todi yak bilki sho ne mistyat tegu zalishayutsya v rozchini j mozhut buti viddilenni promivannyam kolonki fosfatnim buferom Pislya cogo rekombinantnij bilok mozhe buti znyatij z polimernogo nosiya za dopomogoyu buferu sho mistit 150 300 mM imidazolu Kilkist ta yakist otrimanogo bilka mozhe buti viznachena za dopomogoyu SDS PAGE ta Vestern blotu Afinna ochistka bilkiv za dopomogoyu poligistidinovogo tegu daye vidnosno chisti bilki pislya ekspresiyi v prokariotichnih klitinah Zalezhno vid oblasti zastosuvannya ochistka bilkiv pislya ekspresiyi v eukariotah mozhliva z vikoristannyam tandemnoyi afinnoyi ochistki koli dva tegi vikoristovuyutsya dlya otrimannya bilka bilsh visokoyi chistoti Poligistidinovij teg ye garnim metodom ochistki bilkiv za denaturuyuchih umov tomu sho z vyazuvannya bilka z helatorom na polimeri ne zalezhit vid prisutnosti denaturuyuchih agentiv u seredovishi Vvedennya teguVvedennya poligistidinovogo tegu A His teg vvoditsya vstavkoyu DNK yaka koduye potribnij proteyin zelenij u plazmidnij vektor sinij yakij vzhe mistit poslidovnist DNK chervona sho koduye shist gistidiniv na C kinci majbutnogo polipeptidu B His teg vvoditsya v gen potribnogo bilku za dopomogoyu PLR u prisutnosti prajmeriv iz vidpovidnoyu dodatkovoyu vstavkoyu chervona do N kincya Najbilsh poshirenoyu versiyeyu poligistidinovogo tegu ye taka sho mistit shist poslidovnih zalishkiv gistidinu 6xHis teg yaki dodayutsya do bilku na N kinec pered zalishkom metioninu abo na C kinec odrazu pered stop kodonom Vibir sposobu michennya N C kinec zalezhit golovnim chinom vid vlastivostej bilku ta metoda vidalennya tegu pislya ekspresiyi Michennya po okremomu kincyu nemozhlive yaksho vin gliboko zanurenij v proteyinovu globulu abo yaksho vin vikonuye pevnu funkciyu Bilshist ekzopeptidaz mozhut vidaliti poligistidinovij teg tilki yaksho vin roztashovanij na N kinci Ye dva zagalni metodi vvedennya tegu v polipeptidnu strukturu bilku Najbilsh prostim metodom ye vstavka genu sho koduye bilok v plazmidu abo inshij vektor sho vzhe mistit poslidovnist koduyuchu His tag takim chinom pislya vstavki genu v vektor teg odrazu popade v proteyin koduyuchu ramku zchituvannya i buti priyednanij do proteyinu pid chas ekspresiyi Inshim zagalnim metodom ye amplifikaciya genu sho koduye cilovij bilok za dopomogoyu polimeraznoyi lancyugovoyi reakciyi PLR u prisutnosti specialno stvorenih prajmeriv odin z pari prajmeriv maye mistiti dekilka raz povtorenij gistidinovij kodon CAT abo CAC vpritul do start abo stop kodoniv na dodachu do vlasne poslidovnosti prajmera komplementarnoyi do kincevih nukleotidnih osnov genu Priklad prajmeriv stvorenih dlya vvedennya geksagistidinovogo tegu za dopomogoyu PLR Visimnadcyat nukleotidiv sho koduyut shist gistidiniv vstavleni bezposeredno pislya START kodonu abo bezposeredno pered STOP kodonom Yak minimum 16 nukleotidiv prajmeru mayut buti komplementarnimi do terminalnih fragmentiv genu sho koduye potribnij bilok Zavdyaki vstavci shesti gistidiniv bilok staye vazhchim priblizno na 1 kDa Zazvichaj na dodachu do geksagistidinovogo tegu minimalnij linker takij yak gly gly gly abo gly ser gly vstavlyayetsya mizh nim ta proteyinom ce minimizuye vpliv tegu na vlastivosti cilovogo bilku DetekciyaPoligistidinovij teg mozhe buti vikoristanij dlya identifikaciyi michenogo bilku vestern blot fluorescentna mikroskopiya tosho za dopomogoyu His6 specifichnih antitil PosilannyaHochuli E Bannwarth W Dobeli H Gentz R Stuber D 1988 Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent Nature Biotechnology T 6 11 s 1321 1325 doi 10 1038 nbt1188 1321 Hengen P 1995 Purification of His Tag fusion proteins from Escherichia coli Trends in Biochemical Sciences T 20 7 s 285 6 doi 10 1016 S0968 0004 00 89045 3 PMID 7667882 Gavin AC Bosche M Krause R Grandi P Marzioch M Bauer A Schultz J Rick JM ta in 2002 Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes Nature T 415 6868 s 141 7 doi 10 1038 415141a PMID 11805826