Azərbaycanca AzərbaycancaБеларускі БеларускіDansk DanskDeutsch DeutschEspañola EspañolaFrançais FrançaisIndonesia IndonesiaItaliana Italiana日本語 日本語Қазақ ҚазақLietuvos LietuvosNederlands NederlandsPortuguês PortuguêsРусский Русскийසිංහල සිංහලแบบไทย แบบไทยTürkçe TürkçeУкраїнська Українська中國人 中國人United State United StateAfrikaans Afrikaans
Підтримка
www.wikidata.uk-ua.nina.az

Профілювання полісом техніка в молекулярній біології яка використовується для вивчення асоціації мРНК з рибосомами Важли

Профілювання полісом

Профілювання полісом

Профілювання полісом - техніка в молекулярній біології, яка використовується для вивчення асоціації мРНК з рибосомами . Важливо зазначити, що ця методика відрізняється від профілювання рибосом . Обидві методики були розглянуті і обидві використовуються в аналізі транслатома, але дані, які вони генерують, мають дуже різні рівні специфічності. При використанні експертами, методика просто відтворювана: 3 профілі на першому зображенні взято з 3 різних експериментів.

image
Полісоми

Процедура

Процедура починається з виготовлення клітинного лізату клітин, що цікавлять. Цей лізат містить полісоми, моносоми (складаються з однієї рибосоми, розташованої на мРНК ), малу (40S в еукаріот ) і велику (60S в еукаріот) рибосомні субодиниці, «вільну» мРНК і безліч інших розчинних клітинних компонентів.

Процедура продовжується створенням безперервного градієнта сахарози безперервно змінної щільності в центрифужній пробірці. У використовуваних концентраціях (у прикладі 15-45%) сахароза не порушує асоціацію рибосом і мРНК. 15% градієнта знаходиться у верхній частині трубки, а 45% – унизу через різну щільність .

Певна кількість (як вимірюється оптичною густиною ) лізату потім акуратно наноситься поверх градієнта в трубці. Незважаючи на те, що лізат містить велику кількість розчинного матеріалу, щільність набагато менша, ніж 15% сахарози, тому його можна зберігати як окремий шар у верхній частині пробірки, якщо це робити обережно.

Для розділення компонентів лізату препарат центрифугують. Це прискорює компоненти лізату з силою тяжіння, яка у багато разів перевищує силу тяжіння, і таким чином просуває їх через градієнт залежно від того, наскільки «великими» є окремі компоненти. Малі (40S) субодиниці просуваються менше в градієнт, ніж великі (60S) субодиниці. Рибсоми 80S на мРНК подорожують далі (зверніть увагу, що внесок розміру мРНК у пройдену відстань незначний). Полісоми, що складаються з 2 рибосом, подорожують далі, полісоми з 3 рибосомами подорожують ще далі і далі. «Розмір» компонентів позначається S, одиницею Сведберга . Зверніть увагу, що один S = 10 −13 секунд, і що концепція «великого» насправді є надмірним спрощенням.

Після центрифугування вміст пробірки збирають у вигляді фракцій зверху (менші, повільніше) до низу (більші, швидше) і визначають оптичну щільність фракцій. Перші видалені фракції містять велику кількість відносно малих молекул, таких як тРНК, окремі білки тощо.

Додатки

Цю техніку можна використовувати для вивчення загального ступеня трансляції в клітинах (наприклад, ), але її можна використовувати набагато більш конкретно для вивчення окремих білків та їх мРНК. Як приклад, показаний у нижній частині малюнка, білок, який становить частину малої субодиниці, спочатку може бути виявлений у фракції 40S, потім майже зникає з фракції 60S (поділ на цих градієнтах не є абсолютним), а потім знову з’являється у 80-х роках і полісомні фракції. Це вказує на те, що в клітині міститься дуже мало білка, який не є частиною малої субодиниці. Навпаки, у верхньому рядку фігури імуноблоту розчинний білок з’являється у розчинних фракціях і пов’язаний з рибосомами та полісомами. Конкретний білок є білком-шапероном, який (коротше кажучи) допомагає згортати новонароджений пептид, коли він екструдується з рибосоми. Як і інша робота

Досліджено існування прямого зв’язку шаперона з рибосомою.

Техніка також використовується для вивчення ступеня трансляції конкретної мРНК . У цих експериментах 5'- і 3'-послідовності мРНК досліджувалися на предмет їх впливу на кількість утвореної мРНК і на наскільки добре транслювалися мРНК. Як показано, не всі ізоформи мРНК транслюються з однаковою ефективністю , навіть якщо їх кодуючі послідовності однакові.

Список літератури

  1. Piccirillo, CA та ін. (2014). Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6): 503—511. doi:10.1038/ni.2891. PMID 24840981.
  2. Hanebuth, MA та ін. (2016). Multivalent contacts of the Hsp70 Ssb contribute to its architecture on ribosomes and nascent chain interaction. Nature Communications. 7: 13695. Bibcode:2016NatCo...713695H. doi:10.1038/ncomms13695. PMC 5150220. PMID 27917864.
  3. Lin, CJ та ін. (2010). The antidepressant sertraline inhibits translation initiation by curtailing mammalian target of rapamycin signaling. Cancer Research. 70 (8): 3199—3208. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-4072. PMID 20354178.
  4. Coudert, L та ін. (2014). Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments (87). doi:10.3791/51164. PMC 4193336. PMID 24893838.
  5. Molon, M та ін. (2016). The rate of metabolism as a factor determining longevity of the Saccharomyces cerevisiae yeast. Age (Dordrecht, Netherlands). 38 (1): 11. doi:10.1007/s11357-015-9868-8. PMC 5005888. PMID 26783001.
  6. Floor, SN; Doudna, JA (2016). Tunable protein synthesis by transcript isoforms in human cells. eLife. 5. doi:10.7554/eLife.10921. PMC 4764583. PMID 26735365.{{}}: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом ()

Вікіпедія, Українська, Україна, книга, книги, бібліотека, стаття, читати, завантажити, безкоштовно, безкоштовно завантажити, mp3, відео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, малюнок, музика, пісня, фільм, книга, гра, ігри, мобільний, телефон, android, ios, apple, мобільний телефон, samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Інтернет

Profilyuvannya polisom tehnika v molekulyarnij biologiyi yaka vikoristovuyetsya dlya vivchennya asociaciyi mRNK z ribosomami Vazhlivo zaznachiti sho cya metodika vidriznyayetsya vid profilyuvannya ribosom Obidvi metodiki buli rozglyanuti i obidvi vikoristovuyutsya v analizi translatoma ale dani yaki voni generuyut mayut duzhe rizni rivni specifichnosti Pri vikoristanni ekspertami metodika prosto vidtvoryuvana 3 profili na pershomu zobrazhenni vzyato z 3 riznih eksperimentiv PolisomiProceduraProcedura pochinayetsya z vigotovlennya klitinnogo lizatu klitin sho cikavlyat Cej lizat mistit polisomi monosomi skladayutsya z odniyeyi ribosomi roztashovanoyi na mRNK malu 40S v eukariot i veliku 60S v eukariot ribosomni subodinici vilnu mRNK i bezlich inshih rozchinnih klitinnih komponentiv Procedura prodovzhuyetsya stvorennyam bezperervnogo gradiyenta saharozi bezperervno zminnoyi shilnosti v centrifuzhnij probirci U vikoristovuvanih koncentraciyah u prikladi 15 45 saharoza ne porushuye asociaciyu ribosom i mRNK 15 gradiyenta znahoditsya u verhnij chastini trubki a 45 unizu cherez riznu shilnist Pevna kilkist yak vimiryuyetsya optichnoyu gustinoyu lizatu potim akuratno nanositsya poverh gradiyenta v trubci Nezvazhayuchi na te sho lizat mistit veliku kilkist rozchinnogo materialu shilnist nabagato mensha nizh 15 saharozi tomu jogo mozhna zberigati yak okremij shar u verhnij chastini probirki yaksho ce robiti oberezhno Dlya rozdilennya komponentiv lizatu preparat centrifuguyut Ce priskoryuye komponenti lizatu z siloyu tyazhinnya yaka u bagato raziv perevishuye silu tyazhinnya i takim chinom prosuvaye yih cherez gradiyent zalezhno vid togo naskilki velikimi ye okremi komponenti Mali 40S subodinici prosuvayutsya menshe v gradiyent nizh veliki 60S subodinici Ribsomi 80S na mRNK podorozhuyut dali zvernit uvagu sho vnesok rozmiru mRNK u projdenu vidstan neznachnij Polisomi sho skladayutsya z 2 ribosom podorozhuyut dali polisomi z 3 ribosomami podorozhuyut she dali i dali Rozmir komponentiv poznachayetsya S odiniceyu Svedberga Zvernit uvagu sho odin S 10 13 sekund i sho koncepciya velikogo naspravdi ye nadmirnim sproshennyam Pislya centrifuguvannya vmist probirki zbirayut u viglyadi frakcij zverhu menshi povilnishe do nizu bilshi shvidshe i viznachayut optichnu shilnist frakcij Pershi vidaleni frakciyi mistyat veliku kilkist vidnosno malih molekul takih yak tRNK okremi bilki tosho DodatkiCyu tehniku mozhna vikoristovuvati dlya vivchennya zagalnogo stupenya translyaciyi v klitinah napriklad ale yiyi mozhna vikoristovuvati nabagato bilsh konkretno dlya vivchennya okremih bilkiv ta yih mRNK Yak priklad pokazanij u nizhnij chastini malyunka bilok yakij stanovit chastinu maloyi subodinici spochatku mozhe buti viyavlenij u frakciyi 40S potim majzhe znikaye z frakciyi 60S podil na cih gradiyentah ne ye absolyutnim a potim znovu z yavlyayetsya u 80 h rokah i polisomni frakciyi Ce vkazuye na te sho v klitini mistitsya duzhe malo bilka yakij ne ye chastinoyu maloyi subodinici Navpaki u verhnomu ryadku figuri imunoblotu rozchinnij bilok z yavlyayetsya u rozchinnih frakciyah i pov yazanij z ribosomami ta polisomami Konkretnij bilok ye bilkom shaperonom yakij korotshe kazhuchi dopomagaye zgortati novonarodzhenij peptid koli vin ekstruduyetsya z ribosomi Yak i insha robota Doslidzheno isnuvannya pryamogo zv yazku shaperona z ribosomoyu Tehnika takozh vikoristovuyetsya dlya vivchennya stupenya translyaciyi konkretnoyi mRNK U cih eksperimentah 5 i 3 poslidovnosti mRNK doslidzhuvalisya na predmet yih vplivu na kilkist utvorenoyi mRNK i na naskilki dobre translyuvalisya mRNK Yak pokazano ne vsi izoformi mRNK translyuyutsya z odnakovoyu efektivnistyu navit yaksho yih koduyuchi poslidovnosti odnakovi Spisok literaturiPiccirillo CA ta in 2014 Translational control of immune responses from transcripts to translatomes Nature Immunology 15 6 503 511 doi 10 1038 ni 2891 PMID 24840981 Hanebuth MA ta in 2016 Multivalent contacts of the Hsp70 Ssb contribute to its architecture on ribosomes and nascent chain interaction Nature Communications 7 13695 Bibcode 2016NatCo 713695H doi 10 1038 ncomms13695 PMC 5150220 PMID 27917864 Lin CJ ta in 2010 The antidepressant sertraline inhibits translation initiation by curtailing mammalian target of rapamycin signaling Cancer Research 70 8 3199 3208 doi 10 1158 0008 5472 CAN 09 4072 PMID 20354178 Coudert L ta in 2014 Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling Journal of Visualized Experiments 87 doi 10 3791 51164 PMC 4193336 PMID 24893838 Molon M ta in 2016 The rate of metabolism as a factor determining longevity of the Saccharomyces cerevisiae yeast Age Dordrecht Netherlands 38 1 11 doi 10 1007 s11357 015 9868 8 PMC 5005888 PMID 26783001 Floor SN Doudna JA 2016 Tunable protein synthesis by transcript isoforms in human cells eLife 5 doi 10 7554 eLife 10921 PMC 4764583 PMID 26735365 a href wiki D0 A8 D0 B0 D0 B1 D0 BB D0 BE D0 BD Cite journal title Shablon Cite journal cite journal a Obslugovuvannya CS1 Storinki iz nepoznachenim DOI z bezkoshtovnim dostupom posilannya

Дата публікації:
Топ